食品中单核细胞增生李斯特菌的视觉检测

  单核细胞增生李斯特菌危害

  单核细胞增生李斯特菌引起的疾病威胁着生命，并受到公众的广泛关注。由于其无处不在和对恶劣环境条件的耐受性，单核细胞增生李斯特菌可以在制造和分销过程中的多个点污染食品。单增李斯特菌广泛分布于自然环境中，可在土壤、水、排污系统、蔬菜、动物饲料、农场环境、食品加工设备、各种食品、健康动物和人的粪便中分离出来。环境是李斯特菌株主要来源。单增在土壤中存在，在腐烂的植物上作为腐生质存活下来。由于其广泛存在，以及其能在植物-土壤环境中存活并生长，新鲜农产品培育过程以及收获后的处理过程发生单增污染都可能对动物和人的健康带来威胁。由于其超强抗应激性，即使在冷藏温度下，蔬菜上存在的单增菌也会在储存过程中增长。自然界中饲喂鹿的区域和农业生产体系中，如种植地和家畜饲养场，都曾发现高浓度单增李斯特菌的存在。

  单增李斯特菌可以吸附在食品接触表面并形成生物膜，阻碍杀菌效果的有效性。冷藏、潮湿的环境，加上有机土壤物质的沉降，能够使单增李斯特菌在工厂环境中存活并生长。单增李斯特菌也是生产工厂中使用的原料中较为常见的污染物，所以工厂环境中常常能发现该菌。为了控制住该菌，各种可能的进入路径及交叉污染的途径都要予以控制。由于李斯特菌在环境中广泛存在，食品只要未经杀菌处理，就有被存在于生产环境中的该菌污染的可能。国际上由单增李斯特菌导致的食品召回事件层出不穷，近几年来几乎每个月都有因疑似李斯特菌污染的食品召回事件发生，其中涉及食品种类繁多，包括烟熏鱼、奶酪、火腿、水果、沙拉、冷冻饮品等等

  比色检测工作原理

  目前采用各种技术的分子诊断方法用于靶向特定基因以测试单核细胞增生李斯特菌的存在与否。这些方法有一些缺点，例如LAMP的假阳性结果和用于扩增产物终点分析(电泳，荧光)的昂贵设备。因此，有一个紧迫的替代方案来处理这些缺点。

  我们提出的检测原理是经过PCR后，来自单核细胞增生李斯特菌的hly基因信号被极度放大。来自单核细胞增生李斯特菌hly基因被扩增为PCR产物，由于PCR特性，其比单核细胞增生李斯特菌基因组中的初始质量数高出数百万至数十亿拷贝。PCR产物还含有在PCR过程中由一种修饰引物(agRP)产生的DNA酶适配体，因此，大量DNA酶适配体可以与血红素结合，导致完整的DNA酶组装。形成的DNA酶将催化氧化，导致颜色从无色变为绿色。基于上述原理，通过在PCR后系统中加入血红素和DNA酶的催化底物，可以对单核细胞增生李斯特菌进行目视检测。

  视觉检测可行性

  对真实猪肉样本检测进行了视觉检测分析。采用视觉检测策略和培养法分别对20个样品进行评估。结果显示，11个样品采用培养法检测单核细胞增生李斯特菌阳性，而本检测策略可得到相同的结果。与培养方法相比，检测准确率为100%。结果表明，使用基于PCR的视觉检测单核细胞增生李斯特菌是可靠的。

  建立了用于单核细胞增生李斯特菌检测的快速比色方法，PCR和DNA酶催化反应的级联将放大和传递靶DNA存在的信号，通过简单且具有成本效益的实验技术可以实现高特异性和灵敏度。

  文献来源：

  Liu, Zhanmin et al. “Development of DNAzyme-based PCR signal cascade amplification for visual detection of Listeria monocytogenes in food.” Analytical biochemistry vol. 553 (2018): 7-11. doi:10.1016/j.ab.2018.05.015