碳点包封纳米胶囊与磁性碳点耦合标记快速灵敏检测降钙素原的两种策略

  摘要：降钙素原(PCT)是临床诊断细菌感染的重要生物标志物。本研究开发了一种利用纳米胶囊和磁性碳点的荧光放大系统的生物传感系统。该系统结合了两种PCT检测策略:高灵敏度免疫磁分离和快速均质免疫测定。在本策略中，用抗体修饰的纳米胶囊作为免疫传感器和能量发射器，而用抗体修饰的磁性碳点作为捕获探针和免疫传感器。该免疫磁分离分析策略采用免疫微囊作为传感器，免疫磁碳点作为捕获探针。该策略证明了在正常免疫反应性和磁分离后，能够在1-1000 pg/mL范围内实现超灵敏的PCT痕量检测。检出限分别为0.3 pg/mL(血清)和0.33 pg/mL(血浆)。利用荧光共振能量转移原理，采用免疫胶囊作为能量传递器，免疫磁性碳点作为传感器的均质免疫分析策略。这使得在稀释后的血清中直接快速检测到0-100 ng/mL范围内的PCT，检测限为0.41 ng/mL。两种方法均具有较高的回收率(93.5% ~ 104.6%和98.4% ~ 103.8%)，且具有实现准确定量PCT检测的可靠性。这种新颖的PCT分析方法可能会扩大基于碳点的免疫荧光传感的潜在用途。此外，它对临床环境中各种血清生物标志物的超灵敏和快速点护理检测具有直接意义。

  图 1：(A)和(B)分别为 xB-CDs@BONs和xR-CDs@MNPs的制备过程。(C)免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点的制备路线以及PCT的两种传感策略

  图1A和图1B分别简要描述了系列xB-CDs@BONs和xR-CDs@MNPs的制备路线。图1C展示了免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点的制备及其对PCT的两种检测策略。在PCT的均质免疫分析策略中，0.2B-CDs@BONs在360 nm的激发条件下被激发。PCT建立0.2B-CDs@BONs与4R-CDs@MNPs之间的FRET通路，导致4R-CDs@MNPs荧光发射(639 nm)，显示PCT浓度依赖性。在免疫磁分离分析策略中，PCT被免疫磁碳点明确捕获，并被免疫荧光纳米胶囊敏感检测。免疫荧光纳米胶囊的荧光发射(约450 nm)在360 nm激发条件下显示出浓度依赖性的PCT增强。而在没有PCT的情况下，没有观察到这两种效果，因此，通过预先确定的PCT标准曲线，可以在20 min内实现串联PCT溶液的两种快速超灵敏检测策略。

  图2 系列xB-CD@BON的形态和结构

  对xB-CDs@BONs的形貌和结构进行了TEM和SEM分析。B-CDs被稳定地封装在xBCDs@BONs内，并且连续封装的B-CDs的数量有明显的变化xB-CDs@BONs(图2A-2D)。此外，在HRTEM下可以观察到B-CDs的晶格间距(0.17 nm)，与我们之前的报道一致。序列xB-CDs@BONs的元素映射揭示了C、N、O和Si元素的存在，证实了B-CDs在xB-CDs@BONs中的稳定封装。超声和离心循环处理后均未见破裂，证明B-CDs在xB-CDs@BONs中被稳定包裹。这些结果初步证明了xB-CDs@BONs系列纳米胶囊的成功制备。此外，系列xBCDs@BONs的粒度分布相对均匀。测得0.1B-CDs@BONs、0.2B-CDs@BONs、0.5B-CDs@BONs和1BCDs@BONs的平均粒径分别为80.2±20.8 nm、77.8±15.7 nm、82.9±15.9 nm和83.7±14.7 nm(图2E)。不同含量的B-CDs对xB-CDs@BONs的粒径无明显影响。

  图3 xB-CDs@BON的理化评估分析

  进一步测定了xB-CDs@BONs的包封效率、FT-IR、XPS、XRD、zeta电位和荧光性能。将不同比例的B-CDs包裹在硅胶壳中形成xBCDs@BONs。xB-CDs@BONs的制备过程如图3A所示。简单地说，通过水解正硅酸四乙酯和双(三乙氧基硅丙基)二硫化物制备了硅壳。B-CDs被理想地封装在内部，形成以B-CDs为核心，有机二氧化硅为外壳的纳米胶囊。

  利用B-CDs的性质可以很容易地测定其在纳米胶囊中的包封效率。图3B描述了B-CDs串联xB-CDs@BONs的封装效率，封装效率在88%以上。经TEM验证，B-CDs在串联xB-CDs@BONs中的封装数量是不同的。另外，从图3C可以看出xB-CDs@BONs由C、N、O和Si元素组成。在整个XPS光谱上出现了102.1、153.1、285.1、40.1和532.1 eV的5个峰，分别对应Si2p、Si2s、C1s、N1s和O1s的结合能，证明xB-CDs@BONs的表面确实含有Si、C、N和O, EDS也证实了这一点。此外，图3D显示了Si2p光谱中101.3、101.8和102.5 eV处的峰，分别代表Si-C、Si-N和Si-O基团。图3E显示了C1s光谱中284.5、285.8、286.4和288.5 eV处的峰，分别代表C-C/C- si、C- n、C-O和C=O基团。

  用FT-IR对B-CDS和xB-CDs@BONs表面的官能团进行了表征，如图3F所示。xB-CDs@BONs谱在1083 cm⁻¹处的吸收峰归因于Si-O-Si的振动吸收峰。1640和3430 cm⁻¹处的吸收峰可分别归因于氨基的伸缩振动和弯曲振动，表明xB-CDs@BONs表面存在氨基。在图3G中，可以观察到B-CD的负Zeta电位为6 mV。相比之下，系列xB-CDs@BONs的负Zeta电位分别为36.5 mV、35.2 mV、34.6 mV和33.9 mV。此外，Zeta电位值呈现出浓度依赖的趋势，证实了xB-CDs@BONs的成功制备。

  在图3H中显示了xB-CDs@BONs的荧光光谱。值得注意的是，xB-CDs@BONs的荧光发射随激发波长的不同而不同。当Ex.增加时，发射峰向更长的波长移动。这一行为可能与xB-CDs@BONs中表面态的分布有关。此外，依赖于激发光发射的特性使得创建FRET系统变得更容易。发射体的发射波长(xB-CDs@BONs)可以很容易地控制，有利于供体和受体之间的能量匹配。图3I显示了系列xB-CDs@BONs的荧光发射光谱(Ex. 360 nm)。据观察，与其他样品相比，0.2B-CDs@BONs的荧光性能更优越，荧光峰强度与其他样品相比有显著差异(图 S5D)。

  图4 系列xR-CDs@MNPs的形态和结构

  通过TEM分析观察R-CDs、MNPs和xR-CDs@MNPs的形态和结构。制备的R-CDs分散良好，粒径为2.5±1.5 nm(图S6)，晶格间距为0.25 nm(图4A)。MNPs的粒径相对均匀，粒径为10±1.5 nm(图S6)，晶格间距为0.31 nm(图4B)。MNPs的元素映射主要显示了Fe和O元素的存在，少量含有C元素(图S7A)。xR-CDs@MNPs的TEM显示，这些R-CDs的比例对xR-CDs@MNPs的形貌没有明显的影响(图4C-4F)。在xR-CDs@MNPs的HRTEM中观察到两种类型的球形晶体，测量到的晶格间距分别为0.25 nm和0.31 nm，分别对应于R-CDs和MNPs。序列xR-CDs@MNPs的元素图谱包含了R-CDs和MNPs的所有元素，并且C和S元素的含量在序列xR-CDs@MNPs中逐渐增加(图S7B-S7E)。此外，经过循环超声和磁分离处理后，R-CDs和MNPs之间没有分离，表明它们的结合相对紧密。这些发现为成功获取序列xRCDs@MNPs提供了初步证据。

  图5 xR-CDs@MNPs的理化评价分析

  进一步测定了xR-CDs@MNPs的重叠效率、FT-IR、XRD、zeta电位和荧光性能。在所有序列xR-CDs@MNPs中，R-CDs的负载效率都超过了60%(图 5A)。

  此外，利用VSM研究了MNPs和系列xRCDs@MNPs的磁性能(图5B)。两者的磁剖面如图5B所示。MNPs和xR-CDs@MNPs均表现出强磁性。xRCDs@MNPs的饱和磁化强度与R-CDs的浓度有关，分别为62.5、44.5、44.0、42.0和39.2 emu/g。MNPs分散在PBS中，外加磁场可在20s内收集到MNPs(图S9)。因此，在未来的实验中，系列xR-CDs@MNPs纳米复合材料可以很容易地利用外部磁场分离和收集。

  通过XRD分析(图5C)发现xR-CDs@MNPs的衍射峰对应于Fe3O4的(220)、(311)、(511)、(400)晶面。此外，在15-20°范围内出现了一个与原始R-CDs一致的宽衍射峰(见图5C)，这可能表明R-CDs的磁功能化成功。图5D显示了R-CDs、MNPs和序列xR-CDs@MNPs的FT-IR光谱。序列xR-CDs@MNPs在547 cm⁻¹处的吸收峰是由Fe-O-Fe的振动吸收峰引起的，与MNPs一致。2687和2949 cm⁻¹的两个吸收峰可能是由氨基拉伸振动引起的。然而，MNPs没有表现出类似的峰值，这证明xR-CDs@MNPs表面的氨基是由R-CDs引入的。1554和1641 cm⁻¹处的两个吸收峰证明了酰胺键的形成，证实了xRCDs@MNPs中的MNPs和R-CDs通过酰胺键紧密结合。

  图5E显示了系列xR-CDs@MNPs (Ex. 440 nm)的荧光发射光谱。观察到4R-CDs@MNPs与其他样品相比具有优越的荧光性能。假设在给定的比例条件下，4R-CDs@MNPs比其他样品暴露出更多的R-CDs位点。图5F显示，R-CDs的负zeta电位为1.9 mV，而纯MNPs的负zeta电位明显更高，为27.6 mV。有趣的是，xR-CDs@MNPs的zeta电位范围从-20.9到-16.2 mV，表明它介于R-CDs和纯MNPs观察到的值之间。这表明xR-CDs@MNPs的形成影响了纯MNPs的表面电荷，为xR-CDs@MNPs的成功制备提供了进一步的证据。

  图6 免疫荧光探针理化评价分析

  为了精确捕获和识别PCT，采用单克隆抗体对纳米胶囊和磁性碳点进行修饰，制备了免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点。TEM分析证实PCT单克隆抗体可以与0.2B-CDs@BONs和4R-CDs@MNPs形成复合物，如图6A和6D所示。0.2B-CDs@BONs在抗体1 (Ab1)表面分布均匀，而4R-CDs@MNPs在抗体2 (Ab2)周围密集排列。

  为了进一步验证纳米胶囊和磁性碳点的单克隆抗体对修饰，对免疫荧光探针进行了FT-IR、FL、UV-vis和zeta电位检测。图6C为0.2B-CDs@BONs、Ab1和0.2B-CDs@BONs-Ab1的FT-IR光谱。1100 cm⁻¹处的吸收峰是由Si-O-Si的反对称拉伸峰引起的，与0.2B-CDs@BONs一致。2721 cm-1的吸收峰可能与氨基拉伸振动有关。1562和1648 cm⁻¹处的两个牢固的吸收峰证明了酰胺键的形成，证实了免疫荧光纳米胶囊的成功制备。图6E为4R-CDs@MNPs、Ab2和4R-CDs@MNPsAb2的FT-IR光谱。547 cm⁻¹处的吸收峰是由Fe-O-Fe的振动吸收峰引起的，与4R-CDs@MNPs-Ab2一致。2705和2971 cm⁻¹的两个吸收峰可能是由氨基拉伸振动引起的。1562和1648 cm⁻¹处的两个不同的吸收峰证明了酰胺键的形成，证实了免疫荧光磁性碳点的成功制备。

  此外，还对免疫荧光探针的荧光特性进行了评价。检测到0.2BCDs@BONs-Ab1的荧光发射峰，对应Ab1的两个特征峰(410 nm和445 nm)(图6C)。此外，在450nm附近观察到一个宽的发射峰，与原始的0.2B-CDs@BONs一致。该峰的荧光强度明显高于Ab1。此外，在639 nm附近还检测到4R-CDs@MNPs的特征发射峰(如图6F所示)。免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点的紫外可见光谱进一步支持了这些发现(图S11A和S11B)。其次，4R-CDs@MNP的激发光谱与0.2B-CDs@BONs的发射光谱充分重叠(图S11C)，这表明0.2B-CDs@BONs和4R-CDs@MNPs可以作为FRET传感器中的能量供体-受体对。

  图7 免疫荧光探针的优化

  探索了纳米胶囊与单克隆抗体的一系列比例，制备了具有优异荧光性能的免疫荧光纳米胶囊。免疫荧光纳米胶囊在相同浓度下，在360 nm激发下的荧光发射光谱如图7A所示。以500的倍率观察荧光强度峰值。图7B比较了免疫荧光纳米胶囊的荧光发射峰强度。与比值为500的样品相比，比值为100和200的样品的荧光发射峰强度有显著差异。然而，当比例为1000时，样品的荧光发射峰强度没有显著差异。结果表明，当比例为500时，Ab1表面的纳米胶囊数量达到饱和。为了比较免疫荧光纳米胶囊与免疫荧光B-CDs的荧光扩增效果，在相同条件下检测浓度为200 pg/mL的PCT。图7C的结果显示，免疫荧光纳米胶囊的荧光发射峰强度是免疫荧光B-CDs的2.83倍(图7D)，证实了免疫荧光纳米胶囊优越的传感能力。

  探索了磁性碳点与单克隆抗体的一系列配比，制备了具有优异荧光性能的免疫磁性碳点。图7E分析了相同浓度下，在360 nm激发波长下，免疫磁性碳点的荧光发射光谱。比值为50时观察到荧光强度峰值。图7F显示了探针荧光发射峰强度的比较。与比值为50的样品相比，比值为10和20的样品的荧光发射峰强度有显著差异。结果表明，当该比值为50时，Ab2表面的磁性碳点数量达到饱和。但是，比值为100的样品与比值为50的样品的荧光发射峰强度也有显著差异。当比值为100时，这种强度差异可能是由于4R-CDs@MNPs的背景干扰，导致溶液的透过率略低。因此，在上述结果的基础上，我们研究了不同浓度下免疫磁性碳点的荧光发射。图7G显示了这些探针在360 nm激发下的荧光发射光谱。结果表明，探针的荧光发射强度在30 μg/mL时达到最大峰值，然后逐渐降低(图7H)。据猜测，高浓度的4R-CDs@MNPs可能会干扰探针的荧光感应，产生背景干扰。

  图8 PCT免疫磁分离分析策略

  为了初步评价4R-CDs@MNPs-Ab2和0.2BCDs@BONs-Ab1对不同浓度PCT的检测能力，首先在0.1 M, pH = 7.4的PBS中测定荧光光谱。假设PCT被免疫磁碳点明确捕获，并被免疫荧光纳米胶囊敏感地感知。免疫荧光纳米胶囊(450 nm)的荧光发射在360 nm激发下呈现浓度依赖性的PCT增强。0.2B-CDs@BONs-Ab1的荧光强度与PCT呈浓度依赖性(1 ~ 1000 pg/mL)(图8A)。此外，发现荧光强度比(F/F0)与PCT浓度线性化拟合良好(图8B)。线性方程为y = 0.019x + 2.04 (n = 3, R2 = 0.99)， LOD为0.25 pg/mL (3δ/斜率)。然而，F/F0与PCT浓度(大于1000 pg/ mL)之间没有线性关系(图S12)。这种现象证实了我们的假设，促使我们进一步探索PCT在实际样品中的检测情况(图8C-8F)。

  如图8C和8E所示，0.2BCDs@BONs-Ab1的荧光强度仍然表现为PCT的浓度依赖性(1-1000 pg/mL)。从图8D和图8F可以看出，荧光强度比(F/ F0)分别与血清和血浆中PCT浓度具有良好的线性相关性。线性方程分别为y = 0.018x + 2.44 (n = 3, R2 = 0.99)和y = 0.018x + 2.29 (n = 3, R2 = 0.99)。检出限分别为0.3 pg/mL和0.33 pg/mL，低于以往的研究结果(表S1)。血清和血浆样本分析表明，详细的线性拟合结果非常好，与PBS相当，表明该策略可以特异性识别和捕获PCT，同时最大限度地减少背景干扰。PBS、血清和血浆的回收率分别为99.2 ~ 103.4%、93.5 ~ 104.6%和98.4 ~ 103.8%(表S2)。这些相对较高的回收率证明了该策略的可靠性及其准确定量PCT的能力，令人惊讶的是，以4R-CDs@MNPs-Ab2作为感应探针，4R-CDs@MNPsAb2的荧光强度比(F/F0)也与PCT浓度(1-1000 pg/mL)具有良好的线性相关性，进一步支持了该策略的真实性(图S13)。三批免疫传感器在PCT (100 pg/mL)检测中表现出良好的重复性，标准误差为1.3%(图S14A)。与新鲜的免疫传感器相比，在4℃下保存7天的免疫传感器的性能下降了2.3%，表明免疫传感器具有良好的稳定性(图S14B)。此外，制备的免疫传感器对PCT检测具有高特异性(图S14C)。因此，该策略可用于PCT的超灵敏特异检测，为临床检测PCT提供有价值的基础。

  图9 PCT的均质免疫分析策略

  已有研究表明，利用FRET原理，B-CDs-Ab1和RCDs-Ab2之间可以实现0-100 ng/mL的PCT定量检测。假设0.2BCDs@BONs在360 nm的激发条件下被激发。通过PCT在0.2BCDs@BONs和4R-CDs@MNPs之间建立了FRET通路，在4R-CDs@MNPs附近约639 nm处发射荧光。为了评估免疫探针对不同浓度PCT的检测能力，我们首先在0.1 M, pH = 7.4的PBS中测量荧光光谱。荧光强度4R-CDs@MNPs-Ab2在0-100 ng/mL范围内与PCT呈浓度依赖性(图9A)。此外，发现荧光强度比(F/F0)与PCT浓度线性化拟合良好(图9B)。线性方程为y = 0.024x + 1 (n = 3, R2 = 0.99)，检出限为0.34 ng/mL。这一现象证实了我们的假设，并促使我们对实际样品中PCT的检测进行研究(图9C-9F)。

  血清和血浆的高本底干扰可能是由于胆固醇、葡萄糖、蛋白质和其他物质。首先，研究了4R-CDs@MNPs-Ab2在不同血清稀释度下的荧光光谱。我们观察到，当血清稀释因子超过50倍时，对4R-CDs@MNPs-Ab2的荧光发射没有影响(图S15)。在50倍稀释的血清中，4R-CDs@MNPs-Ab2的荧光强度与PCT呈浓度依赖性(0-100 ng/mL)(图9C)，与PBS中的趋势一致。此外，发现荧光强度比(F/F0)与PCT浓度线性化拟合良好(图9D)。线性方程为y = 0.01x + 1 (n = 3, R2 = 0.99)， LOD为0.41 ng/ mL，与我们之前的研究相比，本工作的LOD更低。然而，图9E中描述的策略不能应用于天然等离子体。如图S18所示，即使等离子体稀释1000倍，也完全屏蔽了4R-CDs@MNPs-Ab2的荧光发射。在原始血浆和1000倍稀释血浆中评估了该策略的分析能力。添加不同浓度的PCT(20、40、60、80、100 ng/ mL)与不添加PCT相比，荧光光谱没有明显变化(图S19)。通过计算639 nm处的荧光强度值，发现两者之间没有显著差异(图9F)。PBS和50倍稀释血清的回收率分别为99.7 ~ 103.8%和98.4 ~ 101.5%(表S3)。较高的恢复率表明该策略可靠，对定量PCT具有良好的检测准确性，且检测范围广，操作流程简单，可快速评估患者感染程度。

  图10 PCT两种传感策略的比较

  利用免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点可以实现对实际样品PCT的高灵敏度和宽检测范围的检测。然而，这两种策略之间存在显著差异。首先，两种方法的感知策略不同。免疫磁分离分析策略利用了免疫磁碳点的特异性捕获能力和免疫荧光纳米胶囊的高荧光传感性能。然而，由于需要外部磁场进行筛选，该策略涉及更复杂的操作过程。均质免疫分析策略通过免疫荧光纳米胶囊和免疫磁性碳点之间的FRET机制，消除了分离和洗涤步骤，简化了操作过程。值得注意的是，免疫荧光纳米胶囊具有增强的抗背景信号干扰能力，使其更适合分析复杂样品并提供更好的灵敏度。另一方面，均质免疫分析策略由于高背景信号干扰，灵敏度较低，不适合更复杂的实际样品。总之，尽管这两种策略可能不同，但它们是互利的，它们的整合可以为临床PCT分析提供一种独特的方法(见图10)。

  结论：

  1、 在本工作中，制备的0.2B-CDs@BONs在系列xB-CDs@BONs中具有更优异的荧光性能，并且B-CDs被理想地封装在胶囊内。此外，4R-CDs@MNPs易于实现串联磁性碳点，并表现出优异的综合性能。

  2、 利用抗体修饰0.2B-CDs@BONs和4R-CDs@MNPs的生物传感系统，分别在免疫磁分离分析和均相免疫分析两种策略中对PCT表现出优异的特异性和分析能力。

  3、 该传感系统可方便地在实际样品中实现PCT的快速、超灵敏的定量检测。该免疫磁分离分析策略应用于pg水平(1 ~ 1000 pg/mL)的PCT超灵敏痕量分析，血清和血浆LOD分别为0.3 pg/mL和0.33 pg/mL，具有抗背景干扰能力和高灵敏度。此外，采用均匀免疫分析策略在ng水平上快速分析PCT。LOD测定值为0.41 ng/mL(在50倍稀释的血清中)，易于操作，检测范围为0-100 ng/mL。

  4、 综上所述，磁性和光学相互作用策略有效地满足了临床PCT检测的要求。这种新型的生物传感系统有望成为PCT临床分析的一种新方法，它为临床环境中各种生物标志物的超灵敏和快速即时检测提供了新的可能性。

  参考文献：Liu, B., Lu, S., Yang, K., Dou, X., Feng, X., Cui, H., . . . Tian, F. (2023). Two strategies for rapid and sensitive detection of procalcitonin using carbon dots-encapsulated nanocapsule and magnetic carbon dots as coupled labels. Chemical Engineering Journal, 472, 145038. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.145038.