摘要：在没有笨重和昂贵仪器的情况下对呼吸道合胞病毒(RSV)进行分子诊断对于在快速传播的大流行中早期发现和预防具有重要意义。然而，目前具有代表性的诊断方法存在时间长、成本高、聚合酶链反应(PCR)处理时间长、侧流分析(LFA)不准确等局限性。本文通过引入n -杂环碳烯自组装单层金膜来防止猝灭效应，利用高速光子扫描仪开发了用于原位荧光检测的集成光子数字PCR (dPCR)。现场快速分子诊断平台在8分钟内驱动40个循环，在7分钟内荧光扫描，总分析时间在15分钟内。特别是与标准RT-qPCR相比，该技术清晰地显示了SARS-CoV-2患者和健康对照的分类(RdRp基因的灵敏度为99%，特异性为98.6%，准确性为96.4%)。该平台可用于对即将到来的传染病进行早期诊断和大规模预防的即时护理点分子诊断，并可用于与其他RSV的区分诊断。

  图1.便携式高速扫描仪集成光子dPCR的整体概念，用于快速诊断SARS-CoV-2。a) SARS-CoV-2的形态图示和基因序列。b) CTM中的临床样本采集。c)dPCR芯片和光源进行RNA扩增，热循环取决于LED开/关，以及光源的荧光猝灭/抗猝灭效果。d) 用于现场诊断的便携式dPCR设备。

  插图显示了具有引入的自组装单层有机界面化学品(OICs)，如NHC和硫醇(SH)的Au薄膜，每个图像都显示了OIC在Au薄膜上的键合结构。鼻拭子、咽拭子实际样品通过裂解，与扩增引物等一起在数字PCR中的微流控通道中(图c)快速热循环实现扩增，加热通过LED激光照射金膜实现快速升温，冷却则通过风扇制冷实现。

  图2.金和OICs之间的特征。作者通过XRD、接触角表征证明了金的合成、NHC层和SH层在金膜上的负载，通过XPS、循环伏安法和理论计算验证了NHC与金结合的稳定性强与SH-Au;通过DFT计算得到金和NHC之间的相互作用能(ΔEBind= –25.9002 eV)被证实高于金和SH之间的相互作用能(ΔEBind= −21.211 eV)。引入基于NHC的SAMs(自组装层)作为接触化合物，用于将抗淬灭层与金膜共轭。

  图3.使用光子dPCR确定PCR性能。a) 多层 dPCR 芯片的 3D 结构图示和 dPCR 芯片的照片(下图)。b) dPCR 芯片自吸区分区操作的图示。c) 使用SYBR自吸区分区后结果的荧光图像。d) 用于光子 dPCR 驱动的便携式设备的照片。使用SARS-CoV-2标准试剂盒进行e)NHC和f)SH引入的dPCR芯片的dPCR结果。g) 从灵长类动物获得的样本的结果。h-k) 使用各种临床样品的光子 dPCR 结果的荧光图像。首先通过抽气使微流控孔道内保持真空，减少空气对最终反应器内结果显示的影响，当滴加检测样本时，样本随着微流控孔道流入孔道两侧的微室，然后加入油滴，使样本完全进入微室完成灌注过程。样本的浓度检测通过对荧光亮斑的计数实现。

  图4光子dPCR的评估

  首先通过实时 PCR (RT-PCR) 以获得 SARS-CoV-2 临床样本的诊断结果。dPCR中的微室数量与标准RT-qPCR的Ct值一致，并且测量值在标准Ct值和微室数量之间显示出类似的增加/减少趋势(图4a)。通过与 Ct 值趋势的比较证实了光子 dPCR 的性能。获得受试者工作特征(ROC)曲线来评估光子PCR的可靠性，并根据结果图分析诊断的敏感性、特异性和准确性(图4b)。通过使用 RNA 依赖性 RNA 聚合酶 (RdRp) 基因作为 SARS-CoV-2 诊断标记物，通过阳性/阴性患者临床样本的 ROC 曲线分析结果显示，敏感性为 99%，特异性为96.8%，特异性为 95.3%。便携式光子 dPCR 系统的准确度百分比。分析曲线下面积(AUC)参数(0.996)以证明便携式光子dPCR系统的准确性，并通过与RT-PCR明显相似的临床诊断性能证实了该值(图4c)。瀑布分布显示了基于所有临床样本 (n = 100) 的 T 检验的测试结果(图 4d)。

  图5.便携式扫描仪集成光子 dPCR

  对于现场应用，通过将扫描仪与放大器集成来开发便携式设备。该集成装置由高速旋转光子扫描仪和光子 dPCR 系统组成。便携式 dPCR 系统固定在扫描仪上，由可充电电池供电，并包括用于无线控制的无线通信系统。荧光扫描仪由旋转台、光电二极管和扫描电机组成。通过利用光子 PCR 扩增进行分子诊断来分析 SARS-CoV-2 临床患者样本，使用一步 PCR 方案需要约 25 分钟(图 5c)。由于包含逆转录步骤来扩增病毒 RNA 基因组，因此使用了一步 PCR 方案。特别是，逆转录步骤需要等温步骤，并且设备驱动非常出色，将热精度保持在 0.1 °C 以内(图 5c 插图)。Image 程序用于计数荧光微室的数量。为了评估便携式高速扫描仪集成光子 dPCR 系统的性能，利用 ROC 曲线进行统计分析的有效性评估(图 5e)。我们的便携式平台被评估为对 SARS-CoV-2 具有 99% 的灵敏度、98.6% 的选择性和 96.4% 的准确度，对 H1N1 具有 99.6% 的灵敏度、96.87% 的选择性和 95.4% 的准确度，对 H1N1 具有 99.5% 的灵敏度、98.6% 的选择性和 96.4% 的准确度。对 MERS-CoV 的灵敏度为 %，选择性为 99.6%，准确度为 95.6%，这一性能与独立执行的光子 dPCR 系统相似。

  总结：作者开发了一种用于分子诊断的便携式扫描仪集成光子 dPCR 设备。该装置利用光热转换在15分钟内完成快速扩增和荧光测量，并通过引入一种新型化合物NHC来防止猝灭现象，NHC与Au具有高度稳定的键合以抵抗热应力。通过DFT模拟证明了其高结合能，并且通过结合NHC和DC化合物极大地提高了抗猝灭效果。将该技术引入到基于光子的 dPCR 系统中，与引入硫醇基团的基于光子的系统相比，结果显示出显着的性能。基于这些结果，NHC引入的光子dPCR对100份SARS-CoV-2临床样本进行了诊断，灵敏度为99%，选择性为98.6%，准确度为96.4%。此外，高速光子扫描仪与光子 dPCR 系统集成，作为便携式设备进行现场诊断，使用一次性 SARS-CoV-2 PCR 试剂盒对相同临床样本的总时间消耗显示出超快的性能25分钟以下利用其他RSV进行了利用可能性的确认。此外，与独立执行的光子 dPCR 和荧光显微镜相比，这些结果显示出相似的性能和有效性。因此，该便携式设备可以适用于各种分子诊断领域的现场诊断，并且可以扩展到多种、多种疾病的诊断应用。

  参考文献：Kim K H, Seo S E, Kim J, et al. Ultra‐Fast Photonic Digital Polymerase Chain Reaction based on N‐Heterocyclic Carbene Self‐Assembled Monolayer[J]. Advanced Functional Materials, 2023: 2303728.