麻疹病毒F蛋白的一系列结构解析

麻疹病毒(Measles virus)，隶属副黏病毒科(Paramyxoviridae)，是带有囊膜的单股负链RNA病毒，传染力极强(基本再生数R0高达12-18)。尽管已有预防性疫苗上市，甚至曾经一度推测美国已消灭麻疹【1】，但近几年来，由于病毒的再次引入、重复暴发及疫苗接种率不足等原因，欧美的麻疹发病率激增。而且目前尚无针对麻疹病毒的特效药获批，其防治之路依然任重道远。

麻疹病毒感染宿主主要依赖其囊膜表面的糖蛋白H(hemagglutinin)和F(fusion)，H负责受体结合，F介导膜融合过程。接种疫苗后机体产生的抗体可靶向两种糖蛋白，但研究发现大多数中和抗体直接靶向H蛋白【2】，靶向F的抗体往往不具备中和活性。

F蛋白是一种典型的I型病毒囊膜蛋白，以前体蛋白F0合成后，被酶切为N端的F2和C端的F1亚基，两者由一对二硫键连接【3】。处于融合前构象时，三组F1-F2亚基组成同源三聚体;当病毒H蛋白与宿主受体结合后，膜融合过程激活，F蛋白开始向融合后构象转变，最终形成六螺旋束的伸长型融合后构象，该过程将病毒囊膜与宿主细胞膜拉近，直至发生膜融合，促使病毒遗传物质释放至宿主细胞内，完成病毒入侵过程。

近日，美国La Jolla研究所的Erica Ollmann Saphire课题组与哥伦比亚大学的Matteo Porotto课题组合作利用冷冻电镜技术，解析出麻疹病毒F蛋白的融合前、后结构及其与一株人源化的鼠单克隆中和抗体的复合物结构;通过体外生化分析及结构比较，发现抗体通过结合融合前构象的F蛋白，使其驻留在构象转变过程中间态，阻止其转变为融合后构象，发挥中和活性。相关研究结果以长文形式发表在Science杂志，题为A neutralizing antibody prevents postfusion transition of measles virus fusion protein。

本文所使用的抗体是作者此前已发表的鼠源单克隆抗体，经人源化改造而来【4】，命名为mAb 77.作者首先评估其体外抗病毒活性，测得半数抑制浓度(IC50)为0.034nM，优于F蛋白抑制剂化合物3G及抑制多肽HRC4.大鼠体内攻毒实验显示，mAb 77可以显著降低肺部的病毒滴度。接着，作者利用细胞融合抑制实验，对比抗体与不同种抑制剂的作用效果，分析显示mAb 77不能完全阻止F蛋白的激活，但可以阻止其由发卡中间态向融合后六螺旋束构象的转变，即抗体结合F蛋白的中间态构象。

为确证抗体中和机制，作者开始进行冷冻电镜结构解析。首先在F蛋白中引入两个天然存在的突变E170G与E455G，可使F蛋白胞外段被弗林蛋白酶正确切割，并多数稳定于融合前构象，由此解析出F蛋白胞外段的融合前结构，分辨率2.11Å，发现其与已发表的F蛋白融合前结构高度相似【5】，仅存在微小构象差异。而后作者解析出F与融合抑制多肽(FIP)的复合物结构，发现FIP通过占据F1亚基形成的疏水口袋将F蛋白锁定于融合前构象。接下来，作者解析出mAb 77与融合前构象F蛋白的复合物结构，发现一个F三聚体上结合有三分子Fab 77.抗体表位位于F三聚体的基部，同时位于一个F单体的F1和F2亚基及相邻F单体的F1亚基之上。抗体主要通过其重链的CDR3、CDR H1、H2及L2参与与F的相互作用，两者间共形成16对氢键及一个盐桥。此外，作者还解析出F胞外段的融合后结构，融合前后结构比较显示，结构域I及F2的N端基本不变，结构域II和III发生数埃位移，构象变化最显著的部分是融合肽及七次重复N端HRN。构象变化过程中mAb 77表位中的3个残基发生显著位移，导致抗体无法结合F蛋白的融合后构象。

介于自然界中存在22种麻疹病毒基因型，作者还比较了不同基因型中mAb 77表位的序列差异，发现大部分残基是保守的，仅两个氨基酸存在变异，对抗体结合影响甚微。利用结构比较、DSF、温度分辨的动态光散射等技术，作者发现mAb 77的结合略微增强融合前F蛋白的稳定性，但可以稳定结合融合中间态的方式轻而易举地抑制融合后的构象解聚。通过对F-抗体复合物的精细二维分类，作者最终找到了抗体结合中间态的复合物结构，从而佐证了上述分析。由此提出抗体中和机制的工作模型：mAb 77通过与融合前F不同单体间的结合稳定锚定其上，在H结合受体引发F构象变化时，融合肽释放，该过程抗体依然结合于F蛋白上并阻止F向融合后构象转变，使其锁定于中间态构象。

综上，本文解析出麻疹病毒F蛋白的一系列结构，通过生化和结构生物学手段揭示中和抗体mAb 77的作用机制，可为新一代麻疹治疗药物开发提供参考。

参考文献

1. S. L. Katz, A. R. Hinman, Summary and conclusions: Measles elimination meeting, 16–17 March 2000. J. Infect. Dis. 189 (suppl. 1), S43–S47 (2004).

2. R. L. de Swart, S. Yüksel, A. D. M. E. Osterhaus, Relative contributions of measles virus hemagglutinin- and fusion protein-specific serum antibodies to virus neutralization. J. Virol. 79. 11547–11551 (2005).

3. C. Richardson et al., The nucleotide sequence of the mRNA encoding the fusion protein of measles virus (Edmonston strain): A comparison of fusion proteins from several different paramyxoviruses. Virology 155. 508–523 (1986).

4. C. Mathieu et al., Single-chain variable fragment antibody constructs neutralize measles virus infection in vitro and in vivo. Cell. Mol. Immunol. 18. 1835–1837 (2021).