重大突破！MelArray分子分型新技术揭秘致泄大肠杆菌血清型与致病性关联

由致泄性大肠杆菌（DEC）引起的腹泻病和食源性疾病时常见的持续性公共卫生问题，是发展中国家儿童发病和死亡的主要原因。大肠杆菌根据其特定的毒力基因被分类为不同的致病型，而大肠杆菌的血清型则通过特定的O（脂多糖）和H（鞭毛）抗原组合来定义。区分致病性菌株和非致病性菌株对有效控制DEC感染至关重要。DEC致病型和血清型是疫情分析和流行病检测的关键指标。目前鉴定DEC的致病型和血清型的方法通常分为三步：①利用传统的培养法和生化方法来分离和鉴定大肠杆菌；②利用分子生物学方法检测5种致病性大肠杆菌的特异性毒力基因；③利用血清型方法鉴定O抗原和H抗原。传统方法过程缓慢、劳动强度高、成本效益低且无法覆盖所有的O抗原和H抗原。因此，开发新型分子血清分型检测方法全面分析大肠杆菌血清型与致病型之间的关联，对快速应对食源性疾病爆发具有重要意义。

2024年9月21日，厦门大学李庆阁教授团队联合深圳市疾病预防控制中心扈庆华教授团队在Gut Microbes在线发表题为“Molecular serotyping of diarrheagenic Escherichia coli with a MeltArray assay reveals distinct correlation between serotype and pathotype”的研究性文章。作者介绍了一种成为MeltArray大肠杆菌血清分型检测法的高度多重PCR检测方法，可同时识别大肠杆菌182种O抗原、53种H抗原靶基因和12种毒力因子的分子分型平台，能够在4 h 内鉴定粪便样本种致泄性大肠杆菌的血清型，是一种强大的大肠杆菌分子分型工具。

本研究作者基于高阶多重PCR技术“MeltArray”和“荧光-熔点”二维标签策略，使用229个含以后每个目标基因插入序列的质粒和176株参考菌株，建立了MeltArray EST分子分型平台。该平台仅需5个多重PCR反应即可识别几乎所有已知大肠杆菌血清型。MeltArray EST分子分型平台单个PCR反应最多可检测62个靶基因，创下了闭管PCR一步法检测靶基因数量的新纪录。在176株大肠杆菌参考菌株的验证中，MeltArray EST与传统血清型方法的一致率达96%，与全基因组测序方法的一致率高达100%，证实了其在菌株培养鉴定中的高度准确性。作者在“荧光-熔点”二维标签策略的基础上创造性提出“荧光-熔点-峰高”三位标签策略，通过在阴性粪便中梯度掺入肠道出血性大肠杆菌EHEC的两组模拟实验，证实三维标签策略可直接应用于粪便核酸样本的检测，确定致泄性大肠杆菌毒力基因和血清型特征基因之间的关联。

研究团队通过对深圳市一起食品中毒事件的病例肛拭子样本进行回顾性研究，发现所有的7份病例样本均能检测出肠道致病型大肠杆菌EPEC的特征毒力基因，且熔解峰峰高Rm值与血清型特征基因Gp10及H11呈现强相关关系，确认暴发菌株致病型为EPEC，血清型为Gp10:H11。

为全面评估MeltArray EST大规模应用效果，研究团队在广东、河南、四川、江苏和浙江开展了一项多中心研究。团队收集了637份分离株进行检测和分析以探索大肠杆菌血清型与致病型之间的关联。这些分离株中有93株被归类为非致病性大肠杆菌被排除，其余544株分离株涵盖了5种主要的肠道致病性大肠杆菌病原型的血清型，它们的血清型与5种致病性大肠杆菌病原型之间的关联关系得到了进一步研究。研究人员发现，几乎每种血清型都对应于单一的病原型。进一步分析显示，O血清型、H血清型和O:H血清型与病原型的对应程度分别达到84.5%、70.5%和97.2%，进一步证实了血清型与致病性大肠杆菌病原型之间存在着内在的关联性。

MeltArray EST提供了一种范式转换的分子血清分型工具，可证实DEC血清型与发病型之间的关系。与传统的基于抗血清的大肠杆菌血清分型方法相比，它具有许多优势，包括大量节省时间、劳动力和成本，同时保持高灵敏度和准确性。我们的研究表明，当与MeltArray EST一起使用时，大肠杆菌血清型除了在流行病学研究中不可或缺的作用外，还可以作为DEC感染的可靠疾病生物标志物和疫苗开发的潜在靶标。

参考文献：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2024.2401944#d1e1513