Anal.Chem.:噬菌体修饰透明多孔水凝胶搅拌棒用于快速检测食源性细菌

活食源性致病菌增殖速度极快，如果不及时检测出阳性样本，少量的病原体就会对食品和环境造成很大的影响。因此，宁波大学干宁课题组开发了透明多孔水凝胶搅拌棒，由两种不同的噬菌体（对应于两种不同的细菌（大肠杆菌和副蜂房哈夫尼菌））修饰，用于快速检测食源性细菌。使用小动物活体成像装置可以同时分析大量样品，筛选出阳性样品，同时使用三磷酸腺苷（ATP）生物发光传感器可以量化阳性样品中的细菌数量。该噬菌体对细菌具有良好的特异性和捕获能力，使该方法具有很高的灵敏度。此外，该方法中多种噬菌体的使用也使该方法能够同时检测多种细菌。水凝胶的三维空洞结构使其能够修饰更多的噬菌体，其透明的性质也使其内部的生物发光能够被检测到。两者都能提高检测的灵敏度。最后，还可以将种生物发光所需的试剂，如d -荧光素，预包在水凝胶中，从而简化了检测步骤。在最佳的条件下，该方法的检测范围为^{102 ~ 108 CFU·mL−1}，在11 min内的检出限为^{30 CFU·mL−1}。实际样品的检测结果表明，使用本研究开发的方法与传统的平板计数法没有差异，但检测时间大大缩短。相关成果以“Phage-Modified Clear Hydeogel for Simultaneous Detection of Multiple Bacteria”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上（DOI: 10.1021/acs.analchem.4c03465），博士生曹聪为第一作者，干宁教授，唐科奇教授和余镇重讲师为通讯作者。

研究的主要内容：

方案. (A) 噬菌体修饰丙烯酰胺水凝胶搅拌棒的制备，(B) 捕获细菌后的初步筛选和定量

图1A-H表明了两种噬菌体都具有良好的特异性，只能侵蚀各自对应的细菌。图1I-K展示了噬菌体的大小。两种噬菌体都在200 nm左右，且噬菌体能牢牢地依附于细菌表面。

图1. 噬菌体E-1溶液（104 PFU·mL−1）与(A)大肠杆菌O157:H7（CMCC 44484）、(B) S.A、(C) S.T和(D) V.P. 产生的斑块；噬菌体Ca溶液（104PFU·mL−1）与(E) 副蜂房哈夫尼菌（MCCC 1K06097）、(F) S.A、(G) S.T和(H) V.P. 产生的斑块；(I) 噬菌体E-1、（J)噬菌体Ca和(K) 大肠杆菌O157:H7与噬菌体E-1结合行为的透射电镜图。

图2展示了水凝胶的照片和其内部的三维空洞结构，其中布满了直径大小为10-30 μm的孔洞。从图2C, D中可以看出，水凝胶内部可以容纳数量庞大的被捕获的细菌。图2E-G展示了在水凝胶制备过程中，加入不同含量的N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酰胺和明胶对水凝胶储存模量和损耗模量的影响，以求水凝胶的物理性能达到最佳。

图2. (A) 丙烯酰胺水凝胶搅拌棒；(B) AM水凝胶的三维多孔结构和（C，D）捕获细菌后AM水凝胶内部的SEM图；(E) MBA、(F) AM和(G)明胶含量不同的AM水凝胶的储存模量和损耗模量。

图3比较了噬菌体分别通过化学键合和物理吸附的方法修饰到水凝胶上的牢固程度。通过化学键合进行修饰的噬菌体搅拌棒，在超声前后都能产生较大的噬菌斑。通过物理吸附修饰的噬菌体，在超声前还能产生噬菌体，超声后就不能了。说明超声后，噬菌体从搅拌棒上脱落。证明了我们的化学键合方法对于噬菌体的修饰十分牢固。

图3. (A) 无噬菌体凝胶搅拌棒，(B) 噬菌体修饰凝胶搅拌棒（物理吸附），(C) 噬菌体修饰凝胶搅拌棒（化学键合）超声处理前后的噬菌斑照片。

图4A, B比较了同一浓度的死活细菌，分别用小动物活体成像装置和ATP生物发光传感器进行检测而产生的信号，发现检测活细菌时，两者信号基本一致，检测死细菌时，两者都没有信号。因此，该方法是可以只检测活细菌的含量的。图4C则是具体检测过程的照片。图4. (A)小动物成像仪和(B) 便携式ATP生物发光传感器检测目标细菌（活细菌、死细菌及其混合物）的生物发光强度（n = 3）。(C) 实验过程。

在最佳操作条件下，对噬菌体修饰水凝胶搅拌棒检测目标细菌的性能进行了评价。对大肠杆菌和副蜂房哈夫尼菌在不同浓度（^{102 ~ 108 CFU·mL-1}）的溶液中稀释后进行分析。如图5A、5B所示，随着细菌浓度的增加，生物发光强度逐渐增大。图5C、5D显示了在¹⁰²和^{108 CFU·mL-1}浓度范围内，大肠杆菌和副蜂房哈夫尼菌的浓度对数与生物发光强度之间的线性关系。

图5 (A，B) 不同浓度下大肠杆菌和副蜂房哈夫尼菌的生物发光成像；(C，D)大肠杆菌和副蜂房哈夫尼菌的生物发光强度的标准曲线 (n = 3)。

小结：

在这项工作中，开发了一种针对大量样品中多种活菌的检测策略。通过将噬菌体蛋白壳上的羧基与水凝胶表面的氨基结合，将噬菌体固定在水凝胶搅拌棒上。水凝胶的多孔结构和透明性质都能极大地增强信号强度。生物发光所需试剂的预包封简化了检测程序，节省了时间。在实际检测过程中，先用小动物成像仪对大量样品进行初筛，然后用ATP生物发光传感器对阳性样品进行定量。一次检测可在11 min内完成，检测范围为^{102 ~ 108 CFU·mL-1}，检出限为^{30 CFU·mL-1}。结果表明，该方法可同时检测大量样品中的细菌，节省了大量的时间和人力。

原文链接https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03465?urlappend=%3Fref%3DPDF&jav=VoR&rel=cite-as