牛奶营养丰富的成分为细菌增殖创造了最佳环境，因此抑制微生物生长对于保持乳制品质量和确保消费者安全至关重要。肺炎克雷伯菌是牛奶中的重要污染物，也是牛乳腺炎的主要原因。尽管日益严重的抗生素耐药性导致人们对噬菌体疗法重新产生兴趣，但关于牛奶中克雷伯菌噬菌体的抗菌潜力的研究仍然很少。肺炎克雷伯菌的 K5 血清型因其高毒力和在奶牛养殖作业中的普遍性而备受关注。尽管其临床和经济重要性，但专门针对该血清型的噬菌体的可用性仍然非常有限。在这里，我们成功分离并测序了 2 个 K1 特异性克雷伯氏菌噬菌体 P284 和 P287，以及一个 K5 特异性克雷伯氏菌噬菌体 P252。我们在这些噬菌体中鉴定了具有解聚活性的受体结合蛋白。针对 K5 肺炎克雷伯菌的噬菌体文库通过噬菌体基因组修饰富集。具体来说，我们用 K5 特异性噬菌体 P252 的受体结合蛋白替换了 K1 特异性噬菌体 P284 的受体结合蛋白，导致产生重组噬菌体 T 和 F，它们对 K5 肺炎克雷伯菌表现出特异性的裂解活性。与噬菌体 P252 相比，重组噬菌体 T 和 F 在浮游生物试验中表现出更好和更持久的抗菌潜力。此外，所有这些 K5 特异性噬菌体都可以在 4℃ 和 38℃下显著抑制细菌生长并减少牛奶中的细菌种群。 综上所述，本研究为 K5 特异性噬菌体提供了在乳制品行业管理肺炎克雷伯菌污染和感染方面的潜在应用。

1、     1、噬菌体形态与宿主范围

所有噬菌体均产生透明斑+晕圈，提示具有解聚酶活性，宿主范围显示P252仅裂解K5型，P284/P287仅裂解K1型。

图1：由这 3 种噬菌体形成的清晰斑块周围环绕着一圈晕环

2、基因组分析与RBP替换

P252基因组大小 43.9 kb、P284为44.6 kb、P287为50.6 kb，无毒力基因和耐药基因，安全性高。

图2：CRISPR-Cas9系统替换RBP，成功构建重组噬菌体

2、    3、重组噬菌体表征

重组噬菌体T和F的斑块周围有晕圈，说明保留解聚酶活性，测序确认RBP成功替换（T成功，F有单点突变）。

图3：重组噬菌体的分离及裂解谱

3、    4、体外抗菌效果（液体培养）

重组噬菌体T和F在MOI=0.1–10下均显著抑制细菌生长，效果优于野生型P252，抑菌时间更长。

图4：K5 特异性噬菌体在悬浮培养中的抗菌活性

4、    5、牛奶中抗菌效果

在4°C和38°C下，所有噬菌体均显著降低细菌数量，38°C下对照组发生剧烈发酵，噬菌体组无此现象，重组噬菌体效果更持久。

图5：K5 特异性噬菌体在牛奶中的抗菌活性

结论：成功通过RBP替换实现宿主范围转换，重组噬菌体在牛奶中表现出良好的抑菌潜力。解聚酶可作为辅助治疗手段，但成本较高，研究为乳业中肺炎克雷伯菌的生物防治提供新策略 。

参考来源：10.3168/jds.2024-25895