该研究首次完成了用于兽用活疫苗的减毒单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes, Lm）AUF株的全基因组测序与系统解析，揭示了其长期作为兽医疫苗使用背后的遗传基础。AUF株源自1965年从患神经李斯特菌病的绵羊脑组织中分离出的强毒株“A”，经过17次紫外线照射（UVR）减毒处理，自20世纪60年代末起在前苏联部分地区作为活疫苗广泛应用于家畜李斯特菌病防控。尽管其临床应用历史长达近五十年，但其基因组特征及减毒机制此前从未被系统研究。本研究通过高通量测序与全基因组比较分析，首次揭示了AUF株的完整基因组结构、毒力基因谱、抗性基因组成及其与强毒株之间的遗传差异，为理解其减毒机制、残余毒力及疫苗安全性提供了关键数据。

AUF株基因组为一条环状染色体，长度为2,942,932 bp，GC含量为37.98%，共编码2,963个基因，其中包括2,874个蛋白编码序列（CDSs）、17个假基因、89个RNA基因（包括6个rRNA、67个tRNA和4个非编码RNA）。在功能注释中，发现其携带5个抗生素抗性基因（fosX、mprF、lin、norB和sul），56个与Lm毒力相关的基因，以及5个与应激生存相关的SSI-1岛基因。这些基因的存在表明AUF株在减毒过程中仍保留了一定程度的毒力和环境适应能力。 

图1 基于NCBI GenBank中已发布的单核细胞增生李斯特菌及其他李斯特菌属菌株的全基因组序列，对Lm疫苗株AUF进行系统发育分析。

通过与9株来自不同宿主和地区的强毒参考株进行全基因组比较，研究发现AUF株与Lm标准强毒株EGD和10403S遗传关系最为接近，三者均属于遗传谱系II，且共享相同的克隆复合体CC7，尽管它们的序列类型（ST）不同（AUF为ST1538，EGD为ST12，10403S为ST85）。在核心毒力基因方面，AUF株保留了包括LIPI-1毒力岛（plcA、hly、mpl、actA、plcB和prfA）、inlA和inlB等关键毒力因子，这些基因在宿主细胞入侵、逃逸吞噬体、细胞间扩散等过程中发挥核心作用。尤其是转录调控因子prfA、溶血素hly、内化素inlA/inlB等基因在AUF株中均为完整形式，未发现如EGD株中prfA的G145S突变，提示其毒力调控机制未受显著破坏。

然而，AUF株在多个与毒力相关的基因位点上表现出明显的缺失或变异，可能与其减毒表型密切相关。与强毒株相比，AUF株缺失了包括LIPI-3毒力岛（编码李斯特菌溶血素S）、srtB（编码铁饥饿条件下表达的锚定蛋白）、agrC（参与群体感应调控）、vip（编码昆虫毒素蛋白）、gltB/gltA（与代谢适应性相关）、aut_IVb（自溶素）等在内的14个毒力相关位点。这些基因在Lm的宿主适应、免疫逃逸、生物膜形成及系统性感染中发挥重要作用，其缺失可能显著削弱了AUF株的致病能力。

此外，AUF株在基因组结构上也表现出一定的独特性。其基因组中存在约200个特异性CDSs，主要编码未知功能蛋白、噬菌体蛋白、CRISPR相关蛋白、限制性修饰系统组分等，提示其可能通过水平基因转移或噬菌体整合获得部分遗传元件。与10403S株相比，AUF株有93个独有基因，而与EGD株相比则有97个独有基因，这些基因可能与其特定的宿主适应性或疫苗相关表型有关。值得注意的是，AUF株中未发现金属抗性基因（如cadA、cadC），而这类基因在部分强毒株中存在，可能也与毒力调控有关。

在毒力基因的具体序列层面，AUF株的inlA和inlB基因表现出显著的氨基酸多态性。与参考株相比，InlA蛋白存在至少13个氨基酸替换，InlB蛋白则有多达23个独特突变，这些变异可能影响其与宿主受体的结合能力，从而改变入侵效率。尽管这些基因未发生截短或假基因化，但其功能可能已受到一定影响。此外，AUF株的LLO（hly）蛋白在多个位点也存在特异性替换，如S523K、T309N等，这些变化可能影响其溶血活性或免疫原性。

在抗性基因方面，AUF株携带的5个抗性基因与EGD、10403S等株基本一致，主要涉及对大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类、磷霉素及阳离子抗菌肽的耐受。这些基因的存在可能增强其在宿主环境或抗生素选择压力下的生存能力，但未发现与多重耐药相关的基因扩增或突变。

研究还分析了AUF株中17个假基因的功能与分布，发现其中4个假基因在其他Lm株中为功能性基因，包括一个四肽重复蛋白、一个组氨酸激酶感应蛋白、一个氨基酸通透酶和一个未知功能蛋白。这些假基因的形成可能源于UVR诱导的移码突变或终止密码子提前出现，可能导致其功能丧失，从而削弱细菌的毒力或适应性。例如，组氨酸激酶感应蛋白的失活可能影响细菌对环境信号的响应能力，进而影响其致病性。

尽管AUF株在多个毒力相关位点上表现出缺失或变异，但其仍保留了较高比例的毒力基因（56/92），且部分关键毒力通路未受显著破坏，提示其“残余毒力”可能源于这些基因的保留表达。这一特性也解释了其在实际应用中偶发的疫苗相关不良反应。研究指出，AUF株的减毒并非由单一基因突变引起，而是多基因位点变异、缺失及调控网络变化共同作用的结果。其基因组特征为开发新一代李斯特菌疫苗提供了重要参考，特别是在平衡免疫原性与安全性方面具有重要价值。

综上所述，AUF株作为一株历史悠久的兽用疫苗株，其基因组首次被完整解析，揭示了其在长期疫苗应用中保持稳定性与安全性的遗传基础。研究不仅阐明了其减毒机制与残余毒力的分子基础，也为未来构建更安全、有效的李斯特菌疫苗提供了理论依据和基因资源。通过对AUF株与其他毒力株的系统比较，研究者指出，未来疫苗设计应重点关注LIPI-3、srtB、agrC、vip等毒力岛的缺失，以及inlA/inlB等关键基因的功能调控，以实现更精准的毒力削弱与免疫保护平衡。

来源：10.1038/s41597-024-03440-8