研究背景

在全球抗生素耐药性问题日益严峻的背景下，世界卫生组织（WHO）将多重耐药菌列为优先关注的病原体，其中大肠杆菌O157和MRSA尤为突出。大肠杆菌O157是一种产志贺毒素的病原体，可引发严重的胃肠炎和危及生命的溶血性尿毒综合征；MRSA则常导致皮肤、软组织感染、菌血症等，且死亡率较高。传统抗生素在治疗这些耐药菌感染时效果不佳，且生物膜的形成进一步加剧了治疗难度。生物膜是细菌在细胞外多糖基质中形成的结构，能限制抗生素渗透并诱导细菌耐药细胞的形成，使得感染难以根除。因此，迫切需要开发新型抗菌剂来应对这一挑战。 

研究方法

基因克隆与蛋白表达：从噬菌体DS8基因组中扩增出编码P26ly的基因片段，将其克隆至表达载体pET28a中，构建重组质粒pET28a-P26ly。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta中，在含有乳糖的LB培养基中诱导表达，通过超声破碎细胞后，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化 P26ly。

细胞壁降解活性检测：采用超声破碎法提取痢疾杆菌BSD26的细胞壁，将P26ly与细胞壁混合后在37℃孵育，通过测定OD600值的变化来评估P26ly对细胞壁的降解效率。

抗菌活性评估：利用浊度法、时间杀灭曲线和活菌计数法评估P26ly对多种临床相关病原菌（包括大肠杆菌O157、MRSA等）的抗菌效果。同时，通过扫描电子显微镜观察细菌形态变化，检测细胞膜完整性、质子动力势（PMF）耗散、活性氧（ROS）积累以及ATP泄漏等指标，探究P26ly的抗菌机制。

抗生物膜活性测试：在含有P26ly的培养基中培养细菌，通过荧光成像和结晶紫染色法观察生物膜的形成情况，并测定生物膜的生物量和细菌细胞的代谢活性。

稳定性与活性影响因素分析：考察不同pH值、NaCl浓度、温度和金属离子对P26ly活性的影响，以确定其在不同条件下的稳定性。

研究结论

P26ly的细胞壁降解活性：由图1可知，P26ly能显著降解痢疾杆菌BSD26的细胞壁，使OD600 值降低53%（p<0.001），表明其具有直接的细胞壁降解能力。

抗菌活性：P26ly对多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均展现出良好的抗菌效果。在对大肠杆菌O157和MRSA的时间杀灭曲线实验中，4.5μM的P26ly在60分钟内分别使大肠杆菌O157和MRSA的活菌数减少了2.53log和1.48log（p<0.001），显示出浓度依赖性的杀菌活性（图2）。

抗生物膜活性：P26ly能显著抑制大肠杆菌O157和MRSA的生物膜形成，使生物膜的生物量分别减少了81.8%和76.1%（p<0.001）。同时，P26ly还能降低生物膜中细菌细胞的代谢活性，对大肠杆菌O157和MRSA的代谢活性分别降低了64.6%和56.1%（p<0.01）。

细胞膜破坏与抗菌机制：P26ly处理后的细菌细胞膜流动性降低，质子动力势耗散，ROS产生增加，ATP泄漏显著增多（图4）。扫描电子显微镜观察到P26ly处理后的细菌细胞出现变形、细胞内容物泄漏和结构崩溃等现象（图5），证实了P26ly对细胞膜的破坏作用。

结论与展望

本研究发现的P26ly溶菌酶为解决多重耐药菌问题提供了新的策略。其通过细胞壁降解和细胞膜破坏的双重机制，有效地杀死了耐药菌并抑制了生物膜的形成。与传统抗生素相比，P26ly不易诱导细菌耐药性，且在生理条件下具有良好的稳定性和活性。未来的研究可以进一步探索P26ly的结构与功能关系，通过蛋白质工程改造提高其稳定性和活性，开发基于P26ly的新型抗菌制剂。此外，还可以研究P26ly与其他抗菌药物的联合应用，以实现协同抗菌效果，降低药物剂量，减少耐药性的发展。在临床应用方面，P26ly有望成为治疗多重耐药菌感染和生物膜相关疾病的有效手段，为全球抗生素耐药性危机提供一种新的解决方案。

参考文献链接

DOI：10.1016/J.IJBIOMAC.2025.149288