双组分HPLC检测法"破局"兽用疫苗防腐剂质控困局！

兽用疫苗防腐剂"质控困局"------传统分光光度法的局限与HPLC技术新思路

防腐剂在兽用疫苗中扮演着至关重要的角色，通过防止微生物污染和增殖来保障疫苗质量。然而，防腐剂浓度必须严格控制——添加不足可能导致疫苗在制造、运输、储存或接种过程中发生微生物污染，直接影响疫苗质量；过量添加则可能对动物健康造成毒理学风险。世界动物卫生组织（WOAH）及各国药典机构（包括美国药典USP、英国药典BP）均对防腐剂使用制定了严格要求。在台湾地区，依据《兽药品检验标准》第三章规定，所有灭活疫苗均需进行防腐剂含量检测，每年检测超过1,000批次疫苗。

目前，台湾地区兽用疫苗防腐剂检测主要依赖硫柳汞和苯酚的分光光度法。然而，这些半定量方法存在固有缺陷：依赖不稳定且对温度和光敏感的衍生化试剂，易受复杂疫苗基质干扰，增加了数据误判风险。硫柳汞作为一种有机汞化合物，自20世纪30年代引入以来广泛用于免疫制剂防腐，但因其毒性问题正逐步在全球范围内被淘汰。苯酚则主要用于注射剂防腐，低浓度下呈抑菌作用，高浓度下才具杀菌效果。气相色谱（GC）虽适用于挥发性分析物如苯酚，但硫柳汞对GC常用的高温进样条件敏感，易发生热降解。高效液相色谱（HPLC）则具有明显优势，可在单次运行中同时定量挥发性化合物（苯酚）和热不稳定化合物（硫柳汞），无需热降解。尽管已有HPLC方法分别检测硫柳汞或苯酚，但迄今为止，尚无符合VICH GL2指南的单一HPLC方法能够同时测定兽用疫苗基质中的这两种防腐剂。

"双组分优化"色谱条件突破：C8柱等度洗脱与双相提取策略构建

开发了一种双组分HPLC方法（图1），用于同时测定兽用疫苗中的硫柳汞和苯酚，并按照国际兽药注册技术要求协调会（VICH）GL2指南进行了全面验证（图1）。研究团队采用InertSustain® C8色谱柱（4.6×250mm，5μm），以甲醇-0.1%磷酸缓冲液（pH 7.0，40:60，v/v）含0.1%（v/v）三乙胺作为等度流动相，在245nm波长下进行UV检测，总分析时间为20分钟。样品前处理采用创新的双相提取策略：以四氢呋喃（THF）选择性溶解辅料和佐剂组分，实现苯酚的高效提取；同时以酸性磷酸缓冲液提取并稳定水溶性的硫柳汞。有机相和水相分别独立处理，有效减少了铝佐剂、蛋白质及其他配方辅料引起的基质干扰，同时最小化了交叉提取偏差。

图1 双组分HPLC方法的色谱图

关键发现

1、基于C8反相色谱的双组分HPLC方法，通过等度洗脱与双相提取策略，实现了硫柳汞和苯酚在单次运行中的基线分离与精准定量。

2、灵敏度方面，硫柳汞的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.0005 mg/mL和0.0014 mg/mL；苯酚的LOD和LOQ分别为0.0015 mg/mL和0.0045 mg/mL，均满足常规批签发检测需求。

3、方法稳健性测试显示，流动相比例和流速变化对回收率的影响RSD均<5%，但流动相组成和流速的变化会影响峰对称性和回收率，强调维持一致分析条件的重要性。

未来展望与应用潜力

该研究存在几方面值得关注的要点：其一，方法对流动相组成和流速较为敏感，实验室标准化操作规范在常规使用中应予以强调；其二，虽然中间精密度测试表明操作者和仪器相关变异在可接受范围内，但不同实验室间的转移验证仍需进一步评估；其三，该方法目前适用于含硫柳汞和/或苯酚的灭活病毒、细菌和重组兽用疫苗，而活疫苗和冻干疫苗通常不含此类防腐剂，不在本方法适用范围内。

尽管如此，该研究为兽用疫苗防腐剂检测提供了首个经VICH GL2验证的双组分HPLC方法，代表了质控分析的重要进步。未来研究应聚焦：在更多实验室间开展方法转移验证，评估方法的普适性；探索将方法扩展至其他类型防腐剂（如2-苯氧乙醇）的同步检测；进一步优化样品前处理流程以适应更复杂的疫苗基质；以及推动该方法在国际兽用疫苗批签发体系中的标准化应用。该方法通过单次运行同时定量两种防腐剂，相比传统单组分方法显著减少了样品前处理步骤、缩短了检测时间、降低了人力需求，对于大规模疫苗批签发检测具有重要实践价值，为提升监管能力、增强质量控制透明度、保障动物健康和公众信任提供了科学可靠的分析工具。

参考来源：Chan H-L, Chang C-C, Yang C-Y. Establishment and validation of a dual-analyte high-performance liquid chromatography method for detecting thimerosal and phenol in veterinary vaccines[J]. Scientific Reports, 2026. https://doi.org/10.1038/s41598-026-61857-0.