基于反向遗传学的NS1截短减毒活疫苗实现猪流感病毒广谱交叉保护

猪流感"人畜共患"威胁加剧——传统疫苗的局限与反向遗传学新策略

猪流感病毒（swIAVs）作为人畜共患的重要病原体，其频繁的基因重配和进化对动物和人类健康构成持续威胁。猪呼吸道上皮细胞同时表达禽型（SAα2,3Gal）和人型（SAα2,6Gal）唾液酸受体，使其成为流感病毒的"混合容器"，促进新型重配株的产生，这些重配株具有潜在的跨种传播和大流行风险。中国2011-2018年的监测数据显示，G4欧亚禽源样（EA）H1N1病毒在猪群中占主导地位，且在养猪从业者中检出10.4%的血清阳性率，凸显了其显著的人畜共患适应性。与此同时，2009年大流行H1N1（pdm/09）病毒的内部基因组合已被鉴定存在于当代猪H3N2毒株中，增强了其与人类型受体的结合亲和力，引发对其传播能力的担忧。

"理性重配"疫苗设计突破：PR8骨架搭载异源基因片段的三层减毒策略

以高生长性A/Puerto Rico/8/1934（H1N1；PR8）病毒骨架为基础，通过系统性三步遗传修饰策略构建重组疫苗候选株（图1）。研究团队首先将具有广谱交叉反应性的JGL1和CZ7毒株的HA和NA表面糖蛋白基因插入PR8骨架，获得六基因重配体rPR8-JGL1₆₊₂和rPR8-CZ7₆₊₂。在此基础上，引入犬源LZ57毒株的截短NS基因作为第二层减毒修饰——NS1截短可削弱病毒的干扰素拮抗功能，在降低毒力的同时保留免疫原性。随后，进一步引入犬源L1毒株的M基因作为第三层减毒修饰，该基因在先前实验中已被证实可显著降低PR8病毒在小鼠中的致病性。共成功拯救出五种重组病毒，但rPR8-JGL1₄₊₄的拯救未能成功，提示异源基因片段之间可能存在不兼容性。存活重组病毒在鸡胚中均能高效复制，但生长动力学较亲本PR8病毒有所减弱。值得注意的是，携带JGL1谱系表面糖蛋白的重组株血凝滴度显著降低，而其在MDCK细胞中的复制能力仍保持强劲。空斑实验显示，CZ7来源病毒形成较小空斑，而JGL1来源毒株中仅rPR8-JGL1₅₊₃表现出显著减小的空斑形态，提示其复制特性发生了独特改变。

图1  重组菌株的构建及生物学特性

关键发现

1、rPR8-JGL1₅₊₃在引入截短NS基因后完全丧失了对小鼠的致病性，未引起体重下降或死亡，同时保持了体外MDCK细胞中的复制能力，满足疫苗种子病毒扩增需求。

2、经鼻内免疫后，该疫苗完全抑制了同源H1N1（JGL1）和异源H3N2（GG643）攻毒病毒在肺和鼻甲组织中的复制，3天和5天攻毒后均未检测到病毒载量。

3、rPR8-JGL1₅₊₃免疫小鼠攻毒后肺组织几乎无病理变化，仅见轻微肺泡壁增厚和稀疏炎症细胞浸润；而灭活疫苗免疫小鼠则表现出轻度肺泡壁增厚、浆液性渗出和淋巴细胞浸润，尽管整体肺泡结构基本保留。

未来展望与应用潜力

该研究存在三方面重要局限：其一，免疫学分析未涵盖T细胞应答、黏膜IgA及细胞因子/干扰素谱分析，限制了对减毒活疫苗广谱保护机制的深入理解，特别是截短NS基因增强的细胞和黏膜免疫作用；其二，减毒活疫苗的遗传稳定性、返祖潜力及免疫缺陷宿主中的安全性尚未经严格评估，这是活疫苗平台安全应用的前提；其三，研究仅在BALB/c小鼠模型中进行，疫苗在自然宿主猪中的效力和安全性有待验证，且对更广泛流行毒株的保护持久性需进一步考察。

参考来源：Xiang F, Xu Y, Liu C, et al. A reverse genetics-based NS1-truncated live attenuated vaccine confers broad heterologous protection against swine influenza viruses[J]. Microbial Pathogenesis, 2026, 218: 108638. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2026.108638.