100%抵御牛结节强毒！本土灭活苗彻底规避活苗重组风险，犊牛还能继承母源保护抗体！

研究背景

牛结节病由痘病毒引发，近十年从非洲沿中亚、中俄边境快速跨洲传播；吸血蚊蝇为传播媒介，感染牛高热、皮肤大面积硬结节，奶牛产奶量大幅下滑、肉牛皮毛报废，重症死淘率最高达20%，我国西北、东北牧区每年因境外输入疫情承受持续性经济亏损。现有活疫苗存在不可规避的安全缺陷，当前主流Neethling弱毒活疫苗存在三大产业痛点：免疫后牛短期发热、泌乳量下降；田间野毒与疫苗株发生基因重组，产生新型致病毒株；疫苗可在动物体内复制，存在场内散毒、疫情反复扩散风险；蒙古国早期只能超剂量使用羊痘异源疫苗，交叉保护效果差。2026版《国家动物疫病免疫技术指南》明确，边境无疫缓冲带、规模化奶牛场优先选用灭活疫苗，限制复制型活疫苗大范围使用；同时全国兽用抗菌药减量化行动持续推进，疫病防控由“发病用药治疗”转向“安全免疫前置预防”，同源灭活疫苗成为行业刚需。过往LSD灭活疫苗多采用海外标准参考毒株，缺少本土田间流行毒株完整安全、长效免疫、强毒攻毒全套验证；且无统一标准化攻毒评价方法，本研究采用蒙古国首发DO-21分离株搭建完整动物试验体系，补齐本土灭活疫苗效力数据短板。

研究内容

病毒培养与灭活工艺梯度筛选：毒株来源于2021年蒙古国首例牛结节疫情田间分离DO-21 野毒株；将MDB牛肾细胞培养至80%-90%汇合度，0.1 MOI接种病毒，37℃培养4–5天至80%细胞出现病变（CPE），三次冻融收获病毒液，TCID50法测定病毒滴度；其中灭活条件试验设置2/5/8mM二元乙烯亚胺（BEI）三组灭活浓度，分别孵育6/10/12/24h，硫代硫酸钠中和终止灭活；盲传三代细胞无病变判定完全灭活；最终确定5mM BEI、14–16h孵育为最优灭活工艺。

疫苗乳化与成品质量质控：灭活病毒上清与Montanide ISA 206佐剂按1：1体积比充分乳化；

pH控制8.0–8.5，3000rpm离心10min仅微量上清分层；无菌检测无细菌、真菌污染；肉牛单次肌注2mL，首免28天后加强免疫；兔子单次肌注1mL，21天完成二免。

两级疫苗安全性评价试验：将20只6–8周BALB小鼠均分两组，试验组注射3倍临床使用剂量，连续30天记录采食、精神、注射部位肿胀、死亡情况来进行小鼠安全预试验；将6头14–18月龄本土肉牛均分，试验组一次性注射7倍标准免疫剂量（14mL），持续30天监测体温、食欲、全身皮肤病变来进行肉牛超高剂量安全试验。

兔子预免疫攻毒预筛选试验：10只实验兔子平均分为免疫组、空白对照组；0天首免、2天二免；二免14天静脉注射高滴度DO-21野毒攻毒；连续21天记录发热、皮肤结节、采食下降等临床症状，定期采血检测ELISA抗体水平。

肉牛正式强毒攻毒保护试验：选用10头6–9月龄健康无病肉牛，均分免疫组、空白对照组各5头；0天首免2mL、21天二免；二免14天后静脉注射 1×106.3 TCID50强毒株；攻毒后连续19天每日记录体温、口鼻分泌物、皮肤结节、死亡；定时采血、血常规检测；试验结束剖检，结节组织分离病原并全基因组测序确认毒株。

长效免疫持续跟踪试验：9头不同年龄段成年肉牛完成标准首免+ 28天二免；同步纳入3头免疫母牛及其新生犊牛；免疫后0/14/28/60/90/120/180/240/360天分次采血；同步检测总抗体、中和抗体、细胞免疫IFN-γ分泌水平。

多维度实验室检测方法：采用痘病毒通用试剂盒，S/P比值≥30判定血清阳性；血清梯度稀释，无细胞病变最低稀释度为中和滴度，1：2为阳性临界值；灭活病毒刺激全血，ELISA定量干扰素分泌；提取病变组织DNA，扩增P32基因并纳米孔全基因组测序，确认攻毒毒株为DO-21。

统计学分析规则：采用GraphPad、ASTATSA平台分析，单因素ANOVA联合Tukey事后检验，P＜0.05判定组间差异具有统计学意义，全部数据以均值±标准差表示。

研究结论

疫苗安全性评价结果：小鼠组3倍超高剂量免疫全程30天无死亡、采食正常，无皮肤、注射部位异常；肉牛高剂量组7倍标准剂量仅1头牛出现短暂注射部位肿胀，20天自行消退；全部试验牛体温稳定在37.5–39.5℃正常区间，无发热、皮肤结节、流产等全身毒副反应（图1）。该灭活疫苗安全区间宽，仅存在轻微一过性局部反应，无系统性毒性，适配犊牛、成年母牛、育肥肉牛全品类牛只。

兔子预免疫攻毒结果：免疫组免疫14天起ELISA抗体水平显著高于空白组（P＜0.05），至 120天抗体无明显下滑；空白组攻毒第5天出现发热、第9天食欲废绝，21天缓慢自愈；全部免疫兔子全程无任何牛结节典型临床病变（图2）。故兔子可作为低成本前期预实验模型，快速验证疫苗免疫原性，大幅降低大型肉牛试验成本与生物安全风险。

肉牛同源强毒攻毒保护效果：二免后35/42天免疫牛抗体S/P均值分别达138%、185%，远超阳性阈值；IFN-γ细胞因子同步显著升高，全部个体检出≥1：2阳性中和抗体；空白对照组全部出现口鼻分泌物、头颈躯干硬结节，1头攻毒5天死亡；免疫组全程无发热、皮肤结节、眼鼻流脓，无发病个体；死亡牛结节组织测序确认为DO-21野毒株，证明攻毒模型稳定可靠；免疫牛体内未检出活病毒（图3）。二免14天后可对同源强毒实现100%完全保护，体液免疫+细胞免疫双重机制阻断全身性重症感染。

长效免疫与母源抗体传递：首免60天抗体达到峰值，免疫120天仍有89%肉牛中和抗体阳性；至180天仍33%个体维持有效中和滴度，保护性免疫可持续至少4个月；免疫母牛产下的新生犊牛血清均可检出阳性ELISA与中和抗体，证实初乳可高效传递被动保护，降低犊牛早期感染风险；免疫240天后IFN-γ细胞免疫水平显著下降，长期稳定防控需每6个月加强免疫（图4）。

结论与展望

弱毒活苗仅适合短期疫区应急处置，长期常态化防疫、生鲜乳养殖基地、边境无疫缓冲带必须选用灭活疫苗；灭活疫苗无病毒复制、无基因重组风险，不会造成奶牛减产，完全匹配生鲜乳安全管控政策，是未来主流防疫产品。但是不同地域牛结节病毒基因存在明显差异，直接引进海外毒株疫苗会出现交叉保护不足；国内科研、动保企业应采集北方牧区、西藏本土流行毒株，复刻本研究BEI灭活、佐剂配伍、静脉攻毒全套流程，开发适配本土毒株灭活苗，提升田间实际防护效果。

参考文献链接：https://doi.org/10.1007/s00705-026-06694-2