三重基因减毒痘苗疫苗：单针即可防护猴痘病毒

研究背景

自 2022 年 5 月猴痘全球大流行后，2024 年 I 分支猴痘毒株再度引发多国扩散，WHO 于 2024 年 8 月 14 日第二次宣布猴痘为国际关注的突发公共卫生事件。截至 2024 年 6 月底，病毒已蔓延至 116 个国家，累计近 10 万确诊、208 例死亡。现有获批猴痘疫苗分为两代：ACAM2000 复制型疫苗保护力充足，但易诱发心肌炎、泛发痘疹等严重不良反应；MVA-BN（JYNNEOS）安全性更优，但全球供给极度紧缺，2024 年非洲仅 20 万剂储备却存在 1000 万剂需求，且该疫苗属于高度减毒复制缺陷株，需高剂量、两针程序才能达到理想防护效果，难以应对大规模应急接种需求。基于正痘病毒基因组高度保守的特性，天花疫苗可交叉防护猴痘，因此改造我国广泛使用的天坛痘苗株（VTT），开发安全、单剂高效的新一代疫苗成为迫切研发方向。

痘苗病毒天坛株（VTT）是我国消灭天花时期大规模使用的复制型活疫苗，免疫原性强，但天然存在神经毒力，少数接种者会出现严重不良反应，直接用于猴痘防控风险较高。既往改造策略多单独敲除 TK 或 F4L 毒力基因，虽能降低病毒复制与致病性，但过度减毒会大幅削弱免疫应答；代表毒株 MVA 缺失约 15% 基因组，安全性极高却必须多次接种。研究团队发现，B2R 基因编码 poxin 蛋白，会阻断宿主 cGAS/STING 天然免疫通路、抑制干扰素释放，若同步敲除 TK、F4L（调控病毒 DNA 合成，实现减毒）与 B2R（解除免疫抑制，提升免疫原性），有望同步解决 “减毒后免疫下降” 的核心矛盾，由此设计三重基因缺失突变株 dBTF。

研究结果

研究通过同源重组依次敲除 VTT 的 TK、F4L、B2R 基因，获得单基因、双基因、三基因缺失突变株（dTK、dF4L、dTF、dB2R、dBTF），完成全基因组测序验证遗传稳定性。

图1 构建一种减毒且高度免疫原性的痘苗病毒

在人源细胞 BSC-40、LO2 中培养结果显示，三缺失毒株 dBTF 复制速度最慢，形成的病毒空斑远小于野生型 VTT，证明其哺乳动物细胞复制能力显著受损；蛋白与分子检测证实，仅敲除 B2R 的 dB2R 与 dBTF 可解除对 cGAS/STING 通路的抑制，细胞内 cGAMP、磷酸化 IRF3/TBK1、IFN-β 及抗病毒 ISG56 表达水平大幅升高，实现 “减毒同时增强天然免疫启动” 的设计目标，而仅敲除 TK/F4L 的毒株仍会强力抑制宿主干扰素应答。

研究在兔、免疫健全 BALB/c 小鼠、颅内攻毒神经毒力模型、裸鼠（免疫缺陷）四类动物系统评估毒力：皮内接种家兔后，dBTF 造成的皮肤红斑损伤面积仅为野生 VTT 的 1/3，且损伤愈合速度显著更快；鼻腔高剂量（2.5×10⁶ PFU）攻毒野生 VTT 可造成小鼠 100% 死亡，而 dBTF 组小鼠无死亡、无明显体重下降；颅内注射神经毒力测试中，所有 dBTF 接种小鼠全部存活，脑组织病毒载量为所有毒株最低；最关键的免疫缺陷裸鼠模型中，野生 VTT 致死率 100%，dBTF 组裸鼠全部存活，心、脑、肺、肝等多脏器病毒载量较 VTT 下降上千倍，充分证明三重缺失改造大幅消除病毒致病性、神经毒力，适配免疫低下人群接种场景。

图2 体内减毒三重缺失病毒dBTF

免疫保护实验分为小鼠、非人灵长类两层验证：

小鼠模型：单剂 10⁵ PFU dBTF 肌肉免疫 3 周后，可诱导高水平针对猴痘 I、II 分支的中和抗体与特异性 T 细胞应答；腹腔注射 IIb 分支猴痘病毒攻毒后，对照组小鼠多脏器检出高病毒载量，dBTF 免疫组血浆、心、肝、肺、脑等组织病毒拷贝数下降 2–3 个数量级，无明显体重下降与临床病症。

食蟹猴模型：单剂 2.5×10⁵ PFU dBTF 免疫 28 天后静脉攻毒猴痘 IIb 毒株；对照组猕猴攻毒 10 天皮肤出现 75–452 个痘疹，dBTF 组仅出现 1–6 个皮损，无发热、体重降低等全身症状，外周血、淋巴结、皮肤、内脏组织传染性病毒滴度几乎降至检测下限，且诱导的抗体可交叉中和非洲流行的 I 分支毒株，具备应对多谱系猴痘的潜力。相关性分析显示，中和抗体滴度与动物体内病毒载量呈显著负相关，是核心保护标志物。

总结与展望

本研究基于我国自主天花疫苗天坛株，创新性采用“双毒力基因敲除减毒 + 免疫抑制基因敲除增效”三重编辑策略，开发出 dBTF 新型正痘病毒候选疫苗，解决了传统复制型痘苗疫苗毒副作用强、MVA-BN 供给短缺且需多针接种的双重瓶颈。临床前多物种动物实验证实，dBTF 安全性覆盖免疫健全与免疫缺陷个体，单剂低剂量即可同时诱导强效体液、细胞免疫，对全球流行 II 分支与非洲高危 I 分支猴痘毒株均产生交叉防护，为猴痘全球应急防控提供全新国产疫苗方案。

未来研究可从三方面推进：第一，完成 dBTF 规模化细胞生产工艺开发，验证大规模制备稳定性，弥补当前全球猴痘疫苗产能缺口；第二，开展非人灵长类长期免疫持久性观察，评估单剂保护时长，优化应急接种剂量；第三，探索 dBTF 作为溶瘤病毒载体的潜力，依托其复制受限、强激活抗肿瘤免疫的特性拓展肿瘤治疗应用；最终推进临床试验，评估人体安全性与免疫应答，早日实现新型单剂猴痘疫苗的临床转化，同时为天花、其他正痘病毒的广谱疫苗研发提供标准化基因改造思路。

来源：A new attenuated and highly immunogenic orthopoxvirus vaccine protects against mpox in mice and macaques. DOI: 10.1038/s41541-025-01193-y.