MTS细胞毒性试验领跑兽用自体疫苗替代检测：斑马鱼胚胎模型遇复杂基质兼容性瓶颈

动物试验替代迫在眉睫---3R原则与欧盟指令倒逼疫苗安全性检测转型

兽用自体疫苗（AVs）作为紧急防控工具，在商业化疫苗缺位时由特定病原分离株快速制备，须通过严格的质量保证与安全性检测方可放行。长期以来，批次安全性检测依赖小鼠或豚鼠的体内异常毒性试验（ATT），但该方法终点指标模糊，数据变异性大、特异性差，且易出现假阳性结果。随着欧洲指令2010/63/EU及3R原则（替代、减少、优化）的深入推进，欧洲药品质量管理局（EDQM）已明确于2025年7月废止体内家兔热原试验（RPT），国际兽药协调委员会（VICH）GL59指南亦倡导基于风险的质量控制策略，在确证安全特征后豁免靶动物安全性试验。在此背景下，开发可替代ATT的非动物检测方法成为兽用生物制品质控领域的核心议题。

图1. 各疫苗基质中MTS法测得的细胞存活率临界浓度、平均值及标准差(SD)

五类跨物种矩阵覆盖---从牛肠毒血症到鲑鱼疖病的广谱验证

研究团队选取了2024年度意大利IZSUM制药部门生产需求最高的五种自体疫苗基质，涵盖陆生与水生物种、草食/杂食与肉食动物，以及革兰氏阳性菌与阴性菌（图1）。具体包括：针对牛产气荚膜梭菌A型（Clostridium perfringens type A）的肠毒血症疫苗（终浓度9×10⁸ CFU/mL）、针对鲑鱼杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida）的疖病疫苗（1×10⁷ CFU/mL）、针对绵羊金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的坏疽性乳腺炎疫苗（1.5×10⁹ CFU/mL）、针对兔金黄色葡萄球菌的葡萄球菌病疫苗（1.5×10⁹ CFU/mL），以及针对猪链球菌（Streptococcus suis）的链球菌病疫苗（1×10⁹ CFU/mL）。所有基质经纯化控制后，以0.04%或0.05%甲醛灭活，并确保游离甲醛含量低于0.5 g/L的法定阈值，为后续体外方法比对提供了标准化的样品基础。

分层质控策略成型---MTS初筛联合内毒素与甲醛检测构建非动物放行体系该研究为兽用自体疫苗的非动物安全性检测提供了重要的方法学分层依据。鉴于自体疫苗作为应急制品缺乏商业化疫苗的长期统计一致性与标准化批次历史，直接套用VICH GL59的豁免标准存在监管挑战。L929 MTS试验凭借其高通量、定量精准、成本可控的优势，可作为风险导向检测范式中的敏感初筛步骤，在产线早期识别含过量灭活剂或佐剂的异常批次，避免动物资源的无效消耗。尽管斑马鱼胚胎模型在一般毒理学筛选中具有透明、发育快速及伦理优势（120 hpf前不受动物实验法规约束），但本研究证实其对高有机负荷的兽用疫苗基质适应性不足，难以直接桥接体外结果与哺乳动物体内反应。

关键发现

1、L929细胞MTS毒性试验对五种不同物种来源、不同病原类型的兽用自体疫苗基质均产生了可解释的细胞代谢活力阈值，70%存活临界值能有效区分安全与潜在毒性批次，判别趋势与体内ATT"全通过"结果高度吻合。

2、斑马鱼胚胎FET试验受疫苗复杂基质中有机负荷的物理化学效应严重干扰，未稀释样品及培养基本身即可在24 hpf内诱导100%胚胎死亡；排除甲醛毒性及绒毛膜屏障效应后，渗透压失衡与低氧环境被认为是主要致死因素。

3、在MTS临界浓度下的交叉比对显示，仅坏疽性乳腺炎疫苗的FET预测存活率（76.4%）与MTS实测值（77.3%）高度一致；肠毒血症疫苗的两种方法偏差最大（78.2% vs 12.6%），提示FET在此类基质中的适用性存在显著的产品特异性局限。

未来展望与应用潜力

该研究目前仍面临三方面核心挑战：其一，数据集尚属初步，五种基质的批次量有限，需针对每种疫苗类型积累更大规模的统计样本，以确立具有法规效力的个体化截断值；其二，当前验证仅覆盖细菌类自体疫苗，病毒、真菌基质及含不同佐剂系统的复杂配方是否呈现相似的基质干扰效应，有待进一步评估；其三，MTS试验虽在基础细胞毒性层面表现优异，但无法完全替代对免疫系统、神经系统及全身器官反应的评估，需与重组C因子（rFC）内毒素检测、游离甲醛定量及保护力相关性（Correlates of Protection）数据整合，构建多维度批次表征体系。

未来研究应优先扩展至更多基质类型与商业佐剂平台，探索MTS试验与转录组学、高内涵成像等新型技术的联用，以提升对亚致死毒性及免疫调节效应的解析深度。同时，监管机构需针对自体疫苗的应急属性制定灵活的替代方法验证指南，允许在3R原则框架下采用"滚动式"数据积累策略，逐步推动MTS等成熟细胞试验从辅助检测上升为批次放行的核心依据，最终实现对传统动物毒性试验的全面替代。

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参考来源：Di Paolo A, Liberti R, Anzalone L, et al. Comparison of Zebrafish Embryo Toxicity and L929 Cytotoxicity Assays for Preliminary Quality-Control Assessment of Veterinary Autogenous Vaccine Matrices[J]. Veterinary Sciences, 2026, 13(8): 786. https://doi.org/10.3390/vetsci13080786.