裂解即合成：前噬菌体激活驱动细菌生物膜胞外功能性G-四链体DNA的滚环复制与超结构自组装

背景知识

胞外DNA（eDNA）是细菌生物膜胞外基质的关键结构组分，近年研究还发现其可作为催化剂和胞外电子传递（EET）的导电通道，尤其非经典DNA结构如G-四链体（GQ）能够支架氧化还原活性分子（如核黄素、细胞色素C），促进电子快速转移，并与血红素结合形成具有过氧化物酶样活性的DNAzyme。与此同时，温和噬菌体以前噬菌体形式休眠于细菌基因组中，在SOS响应、氧化应激或饥饿等压力下可被激活，导致细胞裂解并释放噬菌体及胞内物质。某些噬菌体（如λSo、SPP/SPβ、phi29）编码的DNA聚合酶具有滚环复制（RCR）能力，可在体外以环状单链DNA为模板合成大量长链DNA串联体，甚至形成与焦磷酸盐共沉淀的微米级“DNA花”超结构。然而，这种RCR驱动的DNA合成从未在细菌或生物膜中被证实。希瓦氏菌和枯草芽孢杆菌作为重要的环境功能菌，广泛应用于生物能源、微生物燃料电池及废水处理等领域，但它们的生物膜通常eDNA含量较低。因此，利用前噬菌体激活在生物膜胞外空间原位合成并组装功能性DNA结构，有望同时调控生物膜架构并增强其电催化性能。

研究方法

本研究首先合成并连接了两种环状DNA模板：T1模板包含重复GQ编码序列，T2模板为低GC含量的随机序列（阴性对照）。通过荧光染料N-甲基原卟啉（NMP）实时监测GQ-DNA的RCR产物积累。利用多种荧光报告菌株（如希瓦氏菌S2391携带cro::Venus和tn7::CFP，S5558携带λSo衣壳-sfGFP融合蛋白）区分活菌、前噬菌体激活及噬菌体组装的时间节点。通过饥饿培养或丝裂霉素C（MMC）诱导前噬菌体激活，并在体系中加入外源phi29聚合酶以验证胞外RCR。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合多种特异性标记（GQ抗体BG4、B-DNA抗体AB1、膜染料FM 4-64、FRET染料对SYTO60/TOTO-1及NMP）对生物膜中的DNA超结构进行三维成像。利用扫描电子显微镜（SEM）及能谱分析（EDX）表征超结构的形貌与元素组成。通过差分脉冲伏安法（DPV）评估eDNA超结构对生物膜电化学活性的影响。此外，采用酪胺信号放大（TSA）技术检测GQ-DNAzyme的过氧化物酶活性，并利用荧光标记的互补DNA（cDNA）探针验证RCR产物的序列特异性。

研究结果

实时监测显示，在希瓦氏菌野生型及ΔMuSoI ΔMuSoII突变体中，NMP荧光信号（代表GQ-DNA合成）在约300分钟后显著上升，恰好与cro::Venus报告的前噬菌体激活峰（~300 min）及λSo衣壳组装峰（~400 min）吻合，同时活菌CFP信号下降表明细胞裂解；而完全缺失前噬菌体的S6610突变株则无GQ-DNA合成，证明λSo噬菌体聚合酶是RCR的关键。外源添加phi29聚合酶可进一步加速胞外RCR反应。枯草芽孢杆菌单培养及其与希瓦氏菌的共培养体系均检测到快速的GQ-DNA合成，且动力学更快。CLSM成像揭示，希瓦氏菌生物膜中形成了直径可达10 μm的球形、GQ富集的晶体样超结构，该结构在缺乏模板或前噬菌体的对照中完全不存在；而枯草芽孢杆菌及双菌共培养体系中则主要形成长度超过50 μm的线状超结构。DPV分析表明，添加T1模板的希瓦氏菌生物膜氧化还原电流密度较未模板化对照提升约3倍（从≈1.8 nA/cm²增至≈5.3 nA/cm²），提示GQ-DNA超结构具有电子传导及氧化还原介质支架功能。TSA实验证实，仅T1模板衍生的GQ-DNA线具有过氧化物酶活性，而T2模板衍生的非GQ线状结构无此活性，且cDNA探针特异性标记了RCR产物，验证了模板编程的功能性。

图 1 前噬菌体激活与细菌裂解驱动胞外滚环复制及G-四链体DNA合成的时间分辨监测

结论与意义

本研究首次证明，前噬菌体激活不仅导致细菌裂解和eDNA释放，还能通过释放的噬菌体聚合酶与核苷酸在胞外继续驱动滚环复制，实现功能性DNA的原位合成与自组装，从而揭示了一种前噬菌体调控生物膜架构的未知机制。该发现建立了一个通用的活体生物技术平台：通过设计不同的环状模板，可在环境细菌群落中程序化合成具有特定结构（球形或线状）和功能（电化学增强、催化活性）的eDNA超结构。在应用层面，GQ富集的eDNA超结构可显著提升希瓦氏菌生物膜的电化学活性，为增强微生物燃料电池、生物电催化及环境修复过程的效率提供了新策略。此外，饥饿诱导前噬菌体激活的方法具有普适性，可扩展至其他携带RCR能力前噬菌体的环境菌株。这项工作不仅深化了对噬菌体-细菌互作及生物膜胞外基质生物发生的理解，也为合成生物学和生物材料领域开辟了在复杂多细胞环境中构建功能性DNA材料的新途径。

参考来源：Minero GAS, Mørkholt Lund L, Hyldgaard Klausen L, et al. Prophage Activation Triggers Extracellular Synthesis of DNA in Bacterial Biofilms via Rolling Circle Replication. Angew Chem Int Ed Engl. Published online August 24, 2026. doi:10.1002/anie.3695434.