计算设计靶向弓形虫致密颗粒抗原：Rpf-Toxo多表位疫苗展现强效Th1免疫应答潜力

弓形虫全球血清阳性率25.7%---慢性感染与疫苗空白催生计算疫苗学新策略

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛分布于全球的人兽共患原虫，全球人群血清阳性率估计达25.7%，其中非洲（61.4%）、大洋洲（38.5%）和南美洲（31.2%）负担最重。先天性感染可导致脉络膜视网膜炎、脑积水、小头畸形及流产；在免疫抑制宿主中，弓形虫可引发脑、心、肺等致命性炎症。在兽医领域，羊、山羊等家畜的流产和死胎亦造成重大经济损失。

目前，针对急性速殖子阶段的化疗、纳米及植物疗法均存在明显副作用，且无法清除组织包囊。尽管减毒活疫苗Toxovax在羊群中可有效预防先天性传播，但其潜在的毒力回复风险使其无法用于人类。致密颗粒抗原（GRAs）作为弓形虫入侵宿主细胞后分泌的关键效应蛋白家族，可通过调控寄生泡及宿主免疫应答促进虫体存活，其中GRA15、GRA60、GRA76、GRA83以及新近发现的GRAα和GRAβ被证实与毒力及免疫调控密切相关，成为亚单位疫苗设计的理想靶标。

图1. 线性B细胞、HTIL和CTL表位的示意图

计算机模拟全面评估---Rpf-Toxo以高稳定性与TLR-4强亲和力脱颖而出

在结构评估环节，NetSurfP-3.0预测显示四种构建体（图1）均以无规卷曲为主，利于表位域的柔性折叠与免疫识别。经I-TASSER同源建模，Rpf-Toxo最优模型（Model 2）的C-score为−0.77。随后通过GalaxyRefine服务器进行结构精修，获得GDT-HA 0.9721、RMSD 0.355、MolProbity 2.145、Clash score 9.6及Poor rotamers 0.3%的优良参数；PROCHECK分析显示，精修后模型位于Ramachandran图最适区的残基比例从61.7%提升至70.2%，整体骨架几何显著改善。

分子对接研究采用ClusPro 2.0将Rpf-Toxo与人TLR-4/MD-2复合物（PDB: 3FXI）进行蛋白-蛋白对接。结果显示，最优结合构象能量评分为−1424.01，簇大小为23个成员；PRODIGY服务器评估结合亲和力为−20.6 kcal/mol，解离常数（Kd）预测为7.3×10⁻¹⁶ M。Rpf-Toxo与TLR-4的A、B、C链形成241个非键相互作用、30个氢键和9个盐桥，提示其可能通过强效激活抗原提呈细胞启动下游免疫信号。

关键发现

1、基于6种新型GRA蛋白（GRA15、GRA60、GRA76、GRA83、GRAα、GRAβ）筛选的18个表位构建的Rpf-Toxo疫苗，通过结核分枝杆菌RpfE佐剂激活TLR-4通路，在计算机模拟中诱导强烈的Th1型细胞免疫与体液免疫协同应答。

2、Rpf-Toxo兼具高抗原性（VaxiJen 0.9148）、良好可溶性（0.658）与优异稳定性（不稳定指数35.41），且经BLASTp验证无人类蛋白同源序列，无致敏性，安全性与成药性良好。

3、TLR-4分子对接显示结合亲和力达−20.6 kcal/mol，免疫模拟预测三剂免疫后IgG+IgM峰值超170,000，记忆B细胞与T细胞可持续活化至350天，提示显著的长期免疫记忆潜力。

未来展望与应用潜力

该研究目前仍属于纯计算预测阶段，其免疫原性、保护效力及安全性尚需通过体外蛋白表达、细胞实验和动物攻毒模型加以验证。首先，Rpf-Toxo在大肠杆菌中的实际可溶性表达水平、纯化后蛋白的折叠状态及免疫原性需经Western blot和流式细胞术确认；其次，BALB/c小鼠攻毒模型是评估其抗速殖子感染及组织包囊清除能力的必要步骤。此外，所选表位在不同地理株系（如I型、II型、III型）中的保守性尚未评估，这对疫苗的广谱交叉保护效力至关重要。

从转化应用角度，未来需开展分子动力学（MD）模拟以深入解析疫苗-TLR-4复合物的动态稳定性，并探索脂质体、纳米颗粒或mRNA递送平台以提升抗原呈递效率与黏膜免疫应答。鉴于猫是弓形虫的终末宿主，该疫苗平台亦可向兽用方向拓展，开发针对猫和反刍动物的免疫制剂，从源头阻断卵囊排放及先天性传播。同时，多表位疫苗潜在的表位竞争和免疫掩蔽效应需在实验中被逐一排除，以确保各表位在体内的独立识别与协同放大。

值得一提的是，环凯生物动物细胞无血清培养基，专为动物疫苗生产场景研发，可有效规避传统含血清培养基的外源污染风险，减少批次差异，为重组亚单位疫苗的规模化生产提供稳定可靠的支持。

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参考来源：Safari MH, Hosseini SA, Ghiabi S, et al. Rpf-Toxo: A Preliminary Computationally Designed Dense Granule Antigen-Based Multi-Epitope Vaccine Against Toxoplasma gondii[J]. Veterinary Medicine and Science, 2026, 12: e71189. https://doi.org/10.1002/vms3.71189.