定向进化拓宽噬菌体宿主范围：从体外增益到体内局限

糖尿病足感染（DFIs）是糖尿病最严重且最昂贵的并发症之一，常由多重耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）引发，导致住院时间延长、反复抗生素治疗，甚至截肢。随着抗生素耐药性问题日益严峻，噬菌体疗法作为一种精准靶向病原体的替代方案重新受到关注。然而，单个噬菌体的宿主范围通常较窄，难以覆盖临床分离株的遗传多样性，这极大限制了其临床应用。

为突破这一瓶颈，法国蒙彼利埃大学的研究团队采用定向进化（即“噬菌体训练”）策略，对一株新近鉴定的葡萄球菌噬菌体SAVM02进行连续传代培养，旨在拓宽其对糖尿病足感染金黄色葡萄球菌临床分离株的裂解谱。研究不仅评估了训练后噬菌体的宿主范围扩展程度，还从表型、基因组和体内模型等多维度探究了其作用机制与治疗潜力。

研究人员从2018至2024年间收集的DFI和糖尿病足骨髓炎（DFOM）临床标本中，选取了31株金黄色葡萄球菌和28株凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS）作为测试菌株。训练过程基于经典的Appelmans方案，但创新性地将多噬菌体混合训练改为单噬菌体训练。研究者选取8株金黄色葡萄球菌作为训练面板（4株对SAVM02敏感、4株不敏感），将噬菌体与混合菌株共培养，每周从发生裂解的孔中收集裂解液并用于下一轮感染，如此连续传代20轮。在训练的不同阶段（P5、P10、P15、P20），通过斑点测试和液体生长抑制实验评估噬菌体活性的变化。

为探究活性提升的机制，研究者比较了训练前后噬菌体的吸附效率和复制动力学；通过全基因组测序分析训练后噬菌体分离株的突变特征；并在斑马鱼胚胎感染模型中验证训练噬菌体的体内治疗效果。

在20轮连续传代后，训练噬菌体池SAVM02-P20对训练面板中3株原本不敏感的菌株（NSA739、C01P007Nez、C1BP006Pied）展现出强劲的裂解活性，其噬菌斑形成效率（EOP）达到甚至超过生产菌株NSA1385的水平。液体生长抑制实验也证实，从P5到P20，这些菌株的抑制效果逐步增强。然而，ST15型菌株在整个训练过程中始终对SAVM02-P20保持抵抗。

将训练前后的噬菌体对59株临床分离株进行测试后发现：SAVM02仅能感染38.7%的金黄色葡萄球菌（12/31），而SAVM02-P20可感染77.4%（24/31），扩展幅度约39%。其中12株原本不敏感的菌株变为可感染，9株原本敏感的菌株敏感性进一步提高。统计学检验确认这一提升具有显著性（χ²=8.0，P=0.0046）。对凝固酶阴性葡萄球菌，SAVM02-P20虽未使原本耐药的菌株变为敏感，但对部分菌株的裂解活性有所增强。

全基因组系统发育分析显示，SAVM02-P20的宿主扩展主要集中于ST5和ST8型的金黄色葡萄球菌——恰好是训练面板中同时包含敏感株和不敏感株的谱系。而ST59型（均为MRSA）和ST15型菌株SAC2则始终对训练噬菌体不敏感。防御系统分析未发现抗噬菌体防御系统的数量或种类与敏感性之间存在明确关联。

吸附实验显示，训练前后噬菌体对宿主菌的吸附效率无显著差异。然而，复制动力学实验表明，在不敏感菌株C1BP006Pied上，SAVM02-P20在1-2小时内即可达到10⁸–10⁹ PFU/mL，而SAVM02在4小时后仅达到约10⁷ PFU/mL。这说明训练主要提升了噬菌体进入宿主后的复制效率。

对12株从P20池中纯化的噬菌体分离株进行全基因组测序，发现了7处突变。其中3处突变在所有分离株中均存在：HU样DNA结合蛋白的移码插入、Ig样蛋白上游非编码区突变、以及磷酸二酯酶上游非编码区突变。这些反复出现的突变提示其可能对噬菌体适应性提升具有重要作用。

在斑马鱼胚胎感染模型中，SAVM02-P20对完全敏感株NSA1385提供了100%的保护；然而，对原本不敏感的C1BP006Pied，SAVM02-P20未能改善感染后的生存率。这一结果揭示了体外获得的活性增益并不总能转化为体内治疗效益，体内环境中细菌毒力、宿主免疫和噬菌体药代动力学等因素可能发挥了关键作用。

本研究证实，通过定向进化训练单株噬菌体，可将其对金黄色葡萄球菌临床分离株的宿主范围从38.7%显著扩展至77.4%，且活性提升主要源于复制效率的提高而非吸附能力的改变。基因组分析提示HU样蛋白、AAA家族ATPase等相关基因的反复突变可能参与了这一适应过程。

然而，研究也明确指出了噬菌体训练的局限性：宿主扩展具有谱系偏向性（如ST59和ST15型菌株始终不敏感），且体外训练获得的活性增益在体内模型中未必能转化为治疗效益。这一发现强调了将进化策略与生理相关模型相结合的重要性。

研究者指出，未来优化方向包括：扩大训练菌株的遗传多样性覆盖、评估训练表型的长期遗传稳定性、以及探索将训练噬菌体与其他靶向毒力因子的噬菌体联合使用的策略，以迫使细菌走向“进化死胡同”。值得期待的是，训练获得的噬菌体变体源于自发突变而非基因编辑，这在监管层面可能更易被接受为“天然变体”。总体而言，这项研究为噬菌体训练策略在糖尿病足感染中的应用提供了翔实的实验证据，也提醒我们：噬菌体训练是一把有边界的利器——它能够拓宽治疗的覆盖面，但并非万能解药。

参考文献：https://doi.org/10.1038/s41467-026-75746-7