QbD 理念赋能工艺开发：伪狂犬病毒固定床无血清疫苗生产体系搭建

伪狂犬病会给全球生猪养殖行业带来可观经济损失，Bartha‑K61 弱毒株是市面上广泛使用的疫苗毒株。传统伪狂犬疫苗多依托滚瓶体系开展制备，批次之间质量波动较为明显。固定床生物反应器可以实现贴壁细胞高密度培养，但适配该体系的无血清生产工艺公开案例较少。江南大学研究团队引入质量源于设计 QbD 思路，搭配自制管式固定床缩小模型，快速完成 Vero 细胞无血清培养下伪狂犬病毒生产工艺开发，为兽用疱疹类病毒疫苗工艺迭代提供实操参考，相关成果发表于Cytotechnology。

研究将收获液内伪狂犬病毒滴度定义为关键质量属性，借助鱼骨图结合失效模式与影响分析 FMEA 开展全流程风险研判。综合严重程度、发生概率、可检测水平计算风险优先数，培养基类型、初始接种细胞密度、感染时间、感染剂量被识别为高风险关键工艺参数。温度、pH、溶氧这类指标虽然对细胞存在较强影响，但设备报警控制系统可以实现稳定管控，风险优先数值偏低，不再纳入后续实验设计考察范围。

项目先完成无血清培养基筛选，对比 VP‑SFM、ProVERO‑1、Vero‑A 三款商业化产品。ProVERO‑1 无法支撑 Vero 细胞正常传代。Vero‑A 培养体系第七天细胞密度可达 5.4×10⁶ cells/mL，细胞生长状态和含胎牛血清对照组接近，后续全部实验选用这款培养基开展工作。

管式固定床反应器作为缩小模型开展 DOE 实验，覆盖感染时间、感染剂量、初始接种细胞密度三个变量，一共设置 21 组试验。基于多变量回归建立工艺预测模型，模型拟合效果达标，失拟检验结果无统计学差异。感染时间、感染剂量属于显著影响因子，因子之间还存在交互效应。病毒滴度不会随接种剂量、细胞密度持续走高，参数超过一定范围之后产量反而出现回落。细胞培养至 11 天再接种病毒，滴度表现明显下滑，和高密度细胞效应存在关联。

研究设定收获病毒滴度大于 7.4 log₁₀ TCID₅₀/mL、失败概率低于 1% 作为判定标准，借助蒙特卡洛模拟计算得到稳健操作点：感染时间 8.47 天，感染剂量 6.92 log₁₀ TCID₅₀/mL，初始接种细胞密度 0.21×10⁶ cells/mL，同时划定对应的多维设计空间。在该参数区间内开展试验，管式固定床反应器可以拿到预期病毒水平。

把缩小模型得到的工艺条件平移至 1 L Xcell 实验室级固定床反应器。比对葡萄糖消耗速率曲线，两套设备细胞代谢变化趋势保持一致。放大后体系感染第三天病毒滴度最高达到 7.87 log₁₀ TCID₅₀/mL，和缩小模型数据基本持平，证明管式固定床可以作为可靠缩小工具，能够大幅减少大反应器试错带来物料与时间消耗。对比公开文献数据，这套无血清工艺病毒产出水平优于波浪反应器 BHK 悬浮细胞体系。

固定床反应器依靠载体提供附着面积，实现更高细胞载量，但也存在采样受限，无法直接统计载体内部细胞数量的短板，只能依靠代谢指标间接判断细胞状态。整套开发流程证明 QbD 结合缩小模型，不用依赖多轮大罐试生产，就可以高效完成兽用病毒疫苗无血清工艺搭建，这套开发范式具备向其他病毒疫苗推广的潜力。

论文信息：Rapid process development of serum‑free pseudorabies virus production with the Quality by Design approach，Cytotechnology，2020，DOI：10.1007/s10616‑020‑00377‑9