Nanotechnol Sci Appl：根除细菌生物膜的噬菌体疗法

摘要：

生物膜是生活在生物或非生物表面的细菌群落，封闭在细胞胞外聚合物中。它们能够在生物和非生物表面（包括人体组织和医疗设备）形成，是造成慢性感染的主要威胁。此外，目前的抗生素和杀菌剂彻底清除生物膜的能力有限。在这篇综述中，作者概述了细菌生物膜的形成及其特点、负担和噬菌体相关的进化。此外，作者还阐明了噬菌体和噬菌体衍生酶在对抗生物膜内细菌方面的最新应用。从新出现的结果中可以得出结论，尽管噬菌体和噬菌体衍生产品在根除生物膜方面取得了成功，但它们大多不足以消灭所有细菌细胞。不过，将噬菌体和/或噬菌体衍生产品与其他抗菌剂（包括抗生素、纳米粒子和抗菌肽）结合使用，可能是清除医疗器械表面生物膜和治疗人类相关感染的有效方法。

噬菌体在细菌生物膜根除中的应用

由于细菌生物膜对抗生素和宿主免疫的耐受性，人们开始寻找其他方法来对付生物膜中的细菌以及抗生素耐药菌株。噬菌体和噬菌体衍生产品已成为科学家们预防和治疗生物膜及相关感染的抗生素最重要的替代品。基于噬菌体的细菌生物膜破坏疗法包括使用单噬菌体（mono phages）、噬菌体鸡尾酒（phage cocktails）、基因工程噬菌体（engineered phages）和噬菌体衍生酶（phage-derived enzymes）。本节概述了噬菌体和噬菌体衍生产品在破坏细菌生物膜方面的一些最新应用。

单噬菌体（Mono Phages）的应用

单噬菌体疗法中使用为不编码毒力、毒素或AMR基因的天然裂解性噬菌体。此外，噬菌体还不能介导水平基因转移或转导受感染的细菌细胞。单一噬菌体的宿主范围通常很窄，因为它们通常只对同一细菌种类的有限菌株具有特异性。它们在临床、兽医、环境和食品中作为治疗剂和生物控制剂的应用非常广泛。许多单噬菌体已被用于显著抑制生物膜和液体培养物中的存活细菌细胞，能将其减少到最低水平，同时对哺乳动物细胞无明显毒性。目前的研究表明，裂解性单噬菌体破坏生物膜的作用与浓度有关。噬菌体浓度过高会干扰生物膜的破坏，而噬菌体浓度过低可能不足以感染和穿透生物膜。因此，处理时间是细菌生物膜破坏的主要因素，而不是噬菌体的浓度，因此应根据使用情况应用适当的噬菌体浓度。    

噬菌体鸡尾酒（Phage Cocktails）的应用

噬菌体疗法通常以噬菌体混合物或鸡尾酒的形式应用，靶向单个或多个细菌菌株。噬菌体鸡尾酒疗法背后的逻辑是，通过不同的抗菌途径同时针对多种细菌受体进行治疗，可以更有效地减少细菌负担、扩大宿主范围、提高裂解潜力、减轻抗药性或溶原性菌株的发展。在一些研究模型中发现，同时应用多种噬菌体比应用单一噬菌体更能有效地破坏生物膜。

为了扩大噬菌体的裂解菌株谱，并提高治疗性噬菌体混合物的效率，应在鸡尾酒制备中加入含多糖降解酶的噬菌体和不含多糖降解酶的噬菌体。此外，单噬菌体疗法主要是裂解性噬菌体，而噬菌体鸡尾酒则不同，可以是裂解性噬菌体、溶原噬菌体或两者的混合物。由于噬菌体鸡尾酒的宿主范围很广，因此对混合物种生物膜很有效。

基因工程噬菌体的应用

缺乏酶编码基因的噬菌体可通过基因工程表达降解酶，使噬菌体吸附、渗透和扩散到EPS中，从而破坏生物膜。一种编码了内酯酶的工程化T7噬菌体在构建后表达了AiiA内酯酶，可有效降解许多细菌的AHLS。

一些具有非溶解特性的温带噬菌体通过基因工程变成了裂解性噬菌体，能产生用于破坏和清除生物膜的内溶素。在最近的一项研究中，Gardnerella噬菌体上编码的1,4-beta-N-acetylmuramidase型内溶素PM-477经重组表达后，对四种不同的Gardnerella表现出很强的杀菌活性。这种利用噬菌体遗传物质有效破坏生物或非生物表面细菌生物膜的方法可能成为21世纪的一种可行选择。    

噬菌体衍生酶

噬菌体编码的一些酶可能有助于治疗细菌感染和生物膜。根据目前的安全标准和法规，应用噬菌体产品比使用噬菌体本身更容易。因此，有两大类噬菌体降解酶可用于清除生物膜：溶菌酶（lysins）和解聚酶（depolymerases）。

溶菌酶是由革兰氏阳性感染噬菌体编码的肽聚糖水解酶，包括胞壁质酶muramidase、转糖基酶transglycosylase、氨基葡萄糖苷酶glucosaminidase、酰胺酶amidase和内肽酶endopeptidase。由于存在外膜保护层，内溶素（endolysins）抗革兰氏阴性病原体的应用受到了影响，然而，与膜透化剂的结合被证明可以显著提高溶素的效率。最近，基因工程设计出了溶菌酶/阳离子肽组合，称为Artilysins；溶菌酶/细菌素组合，称为Lysocins，而溶菌酶/噬菌体受体结合蛋白，称为Innolysins，预期这是一种很有前途的策略。在抗生物膜活性方面，噬菌体裂解蛋白具有有趣的特性。最近的一项研究调查了噬菌体裂解蛋白CHAPSH3b与毒性噬菌体phiIPLARODI的组合，结果表明，两种抗菌剂在清除金黄色葡萄球菌生物膜方面存在协同作用，与单独使用相比，同时使用噬菌体和溶菌酶能更有效地减少存活细胞数。

噬菌体解聚酶是噬菌体基因组中结构基因区域编码的蛋白质，可识别、结合和消化细菌细胞壁的多糖化合物。EPS主要负责细菌生物膜的结构和功能完整性，并对其毒力产生影响。有趣的是，Gutiérrez等利用从噬菌体vB_SepiS-phiIPLA7提取的EPS解聚酶Dpo7来对付葡萄球菌生物膜。研究显示，除了金黄色葡萄球菌V329形成的不依赖多糖的生物被膜外，Dpo7清除了所有产多糖的葡萄球菌菌株90%以上的生物膜附着细胞。此外，用Dpo7对聚苯乙烯表面进行预处理可使三分之二受测菌株的生物膜生物量减少53-85%。EPS解聚酶Dpo7具有抑制生物膜形成的能力，还能分散表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌不同菌株产生的生物膜。

除了作为抗生物被膜剂的单独活性外，溶菌酶和解聚酶的组合可以实现对生物被膜的有效清除。除了它们的易用性外，噬菌体酶可以作为潜在的抗生物膜剂和抗菌药物（酶制剂）的新候选者。

噬菌体与其他抗生物膜措施的结合应用

有时，噬菌体疗法作为唯一的抗生物膜药物不足以摧毁细菌生物膜。迄今为止，除噬菌体疗法外，人们还提出了几种新的抗细菌生物膜的方法。这些方法包括表面修饰或包被方法，使用破坏生物膜基质剂，如酶（DNase I or dispersin B）和二价阳离子的螯合剂，使用天然存在的抗菌肽或其合成衍生物，以及使用QS抑制剂，如姜黄素，槲皮素，卤代呋喃酮化合物，RNA-Ⅲ-抑制肽，人参提取物，大蒜提取物，以及吡咯菌素或微菌素B17。其他方法包括使用金属类纳米粒子（银、金、钛、铜或锌）、绿色纳米粒子和聚合物类纳米粒子的纳米技术、物理方法（如擦洗和冲洗）、使用化学碱基、酸基制剂、乙醇、二氧化氯或过氧化氢的消毒方法、使用单克隆抗体，以及使用能产生细胞毒性物质（如活性氧）的光激活光敏剂的抗菌光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）。要彻底根除细菌生物膜，建议同时或依次采用噬菌体疗法和其他抗生物膜药物的组合疗法。联合疗法由噬菌体和/或噬菌体衍生酶与纳米粒子、化合物、抗菌肽和消毒剂组成（表1）。

联合治疗主要是基于噬菌体和/或噬菌体衍生产品与抗生素的联合使用。单噬菌体、噬菌体鸡尾酒或噬菌体来源的酶与抗生素的协同作用显示了成功的结果。噬菌体疗法联合抗生素的发展可能是人类与MDR或噬菌体耐药菌之间军备竞赛的有利武器。

在噬菌体与抗生素的应用中，必须考虑治疗给药的顺序，以及它们之间相互作用的性质，因为这些因素可能会影响治疗的结果。然而，为了达到最佳的协同作用，噬菌体治疗必须先于抗生素，正如这些研究证明的那样。Papaianni及其团队应用了一种基于脂肪酸和噬菌体Xcc1-羟基磷灰石复合物的组合抗生物被膜方法，优化了Xanthomonas campestris成熟生物膜的根除策略。在流式细胞系统中X. campestris成熟生物膜的有效清除也得到了证实，从而验证了这些元素间的协同作用，这使得所提出的方法成为提高植物在X. campestris感染中存活率的有效解决方案。Manoharadas和他的同事证明了绿色合成银纳米粒子和噬菌体的协同作用，能以时间依赖的方式从惰性玻璃表面清除预先形成的金黄色葡萄球菌生物膜。此外，纳米粒子和噬菌体的协同作用使生物膜中的细菌细胞失去活力，从而防止了新的感染和后续的定殖。这项工作进一步为在环境、工业或临床环境中使用各种纳米粒子和噬菌体联合治疗单个或多个细菌生物膜的方法提供了一个平台。使用这些联合治疗策略取决于预防或治疗与设备相关的医院感染和本地宿主组织上形成的生物膜的意图。遗憾的是，并不是所有的替代策略都可以用于治疗与患者体内形成的生物被膜相关的感染，例如表面涂层金属、消毒剂、化学化合物和混合物。

噬菌体作为载体去输送抗生物膜制剂的应用

噬菌体除了具有溶菌潜力和抗生物膜活性外，还可以经过改造，用作核酸、纳米材料、治疗药物和诊断探针等载体的运载工具。在这种情况下，溶原性噬菌体可能有兴趣递送与CRISPR相关的可编码DNA核酸酶，以逆转抗生素耐药性，并破坏赋予抗生素耐药性的质粒。此外，已有实验设计了一种能够包裹铜绿假单胞菌噬菌体，并将活性噬菌体递送至骨感染部位的可注射水凝胶。封装噬菌体的水凝胶在封装和释放后仍具有杀菌活性，除了能在体外有效杀死浮游和生物膜表型的宿主细菌外，与不含噬菌体的水凝胶相比，在植入7天后，感染铜绿假单胞菌的小鼠桡骨节感染部位的铜绿假单胞菌活菌数减少了4.7倍。在另一项研究中，一种罕见的噬菌体被用作合成金纳米粒子（AuNPs）的绿色途径，噬菌体激发的AuNPs除了对不同细菌病原体具有抗菌活性外，还能抑制约80%的铜绿假单胞菌生物膜。具有广泛宿主范围的噬菌体还与磁性胶体纳米粒子团簇共轭，以促进其在生物膜中的穿透和随后对于已存在生物膜的清除。随着细菌的不断进化，现在可能比以往任何时候都更需要用纳米颗粒来操纵噬菌体，以对抗生物膜的形成和/或由于抗菌耐药细菌而导致的与其相关的人类感染。

结论

在自然界中，大多数细菌都以生物膜的形式存在。生物膜在医疗设备表面和人体组织上的出现以及它们对抗生素、消毒剂和宿主免疫力的耐受性，给人类生活带来了负担。由于目前可用的抗生素无法完全根除细菌生物膜，因此有必要寻找其他方法来彻底消灭它们。针对细菌生物膜的几种新方法已被提出，如纳米技术、灌溉技术、表面修饰方法和天然肽的使用。然而，以噬菌体为基础的治疗方法，包括应用单裂解性噬菌体、噬菌体鸡尾酒、工程噬菌体和噬菌体衍生酶，似乎能有效摧毁细菌生物膜。不过，通过噬菌体或噬菌体蛋白与其他抗生物膜剂的联合治疗，以及与纳米颗粒结合的噬菌体作为这些抗生物被膜剂的递送载体，可以获得更高的疗效。为彻底消除细菌生物膜，建议：

(I) 还需要更多地了解噬菌体的应用机制，以提高世界对噬菌体疗法的接受程度；

(II) 未来研究的目标应是扩大噬菌体的应用范围，将工程噬菌体及其酶与其他替代剂（如纳米粒子和抗菌肽）结合使用；

(III) 今后的研究还应该推广改良噬菌体作为其他抗生物膜剂的运载工具，从而扩大噬菌体的应用范围；

(IV) 应制定疗效和安全方案，以开发一种基于噬菌体的成熟方法来消除生物膜。

原文信息：Amankwah, S.; Abdella, K.; Kassa, T. Bacterial Biofilm Destruction: A Focused Review On The Recent Use of Phage-Based Strategies With Other Antibiofilm Agents. Nanotechnology, Science and Applications 2021, 14, 161-177.