颠覆认知！FBS不靠蛋白起效，毕赤酵母重组蛋白产量直接翻2倍！

研究背景

毕赤酵母是全球应用最广泛的真核表达宿主，用于HPV疫苗、重组人白蛋白、人造肉血红素、胰岛素等5000余种蛋白工业化生产，具备高密度发酵、真核糖基化修饰、内源分泌蛋白极少等优势。2026国内生物企业公开研发痛点：分泌型重组蛋白在胞内转运阶段极易丢失C端His/c-myc标签，IMAC亲和纯化损耗严重；行业现有优化手段（信号肽突变、敲除蛋白酶、高温胁迫）提升幅度有限，发酵与纯化成本居高不下，制约国产重组疫苗、食品蛋白商业化落地。FBS是酵母-哺乳动物共培养通用营养添加剂，但行业三重矛盾持续发酵：①价格持续走高，工业级FBS单价超万元/升，培养基占生产总成本60% 以上；②动物保护组织持续抵制胎儿采血原料，欧美多国收紧FBS进口监管；③批次间生长因子、小分子组分差异大，发酵重复性差。2026全球细胞肉、合成生物企业集体布局无血清培养基，此前有研究证实牛屠宰血液、内脏是低成本食品级替代原料，但FBS真正起效的核心活性组分长期未知，缺少标准化筛选依据。前期共培养实验仅观察到 FBS能提升毕赤酵母荧光蛋白表达，但该效应的作用阶段、靶点、分子通路无系统性解析；现有研究未区分FBS中蛋白/ 小分子组分的功能差异，无法指导低成本替代原料开发，本研究填补该领域机制空白，同时联动畜牧废弃物循环利用热点，打通产业上下游技术链路。

研究内容

工程菌株与载体构建及验证：选用野生毕赤酵母NRRL Y11430（yJC100）作为原始宿主；分泌型靶菌株pDT300处理：GAP组成型启动子+酿酒酵母α交配因子分泌信号+eGFP 报告蛋白+C端c-myc+6×His纯化标签；定点突变截短菌株pKN1处理：eGFP末端引入终止密码子，完全删除C端标签序列；胞内对照菌株pPICZ-EGFP处理移：除分泌信号肽，仅胞内表达eGFP；空载体pPICZα作为阴性对照，排除载体背景干扰。 

深层微孔板（DWPA）梯度发酵实验：选用BMD（菌体增殖）、BMDY/BMMY（蛋白诱导）、DMEM（细胞共培养基础培养基）作为基础培养基；血清变量分组：添加 10%（v/v）胎牛血清/小牛血清/马血清，空白对照组不添加血清；设置30℃（酵母最适温度）、37℃（哺乳动物共培养温度）平行对照两个温度变量；葡萄糖、甲醇单一梯度实验为碳源变量；培养流程：48 h菌体富集→更换诱导培养基继续培养48 h，样品- 80℃冷冻保存备用。 

SDS-PAGE电泳与Western Blot免疫定量：先进行胞外上清处理：蛋白上样缓冲液煮沸变性； 接着采用4%–20% Tris -甘凝胶电泳，转印至硝酸纤维素膜；其中一抗选用抗GFP、抗c-myc 特异性抗体，HRP标记二抗孵育；最后进行胞内样品制备，用玻璃珠冰浴裂解菌体，离心取上清重复WB检测。 

IMAC 纯化与糖基化验证实验：钴离子亲和柱分离带完整His标签的30 kD eGFP，区分完整蛋白与26.8 kD截短产物； Endo H糖苷酶消化处理样品，验证分子量差异是否来源于N型糖基化修饰。 

LC-MS/MS 定量蛋白质组分析：首先进行样品分组：添加/不添加FBS的胞内裂解液（12 h、24 h两个时间梯度）、纯化胞外eGFP；再进行前处理：蛋白定量、尿素变性、二硫键还原、碘乙酰胺封闭、胰蛋白酶过夜酶解；再用C18小柱脱盐浓缩肽段，Orbitrap三合一质谱上机检测；最后进行生物信息分析：Proteome Discoverer比对毕赤酵母标准蛋白库，差异蛋白筛选标准：校正p＜0.05，至少匹配2条独特肽段。

研究结论

FBS显著提升分泌蛋白总量：不同培养基±FBS胞外GFP免疫印迹；无FBS仅出现26.8 kD 单一条带，添加10% FBS后同时出现26.8 kD截短条带、30 kD完整条带，BMDY、DMEM 两种培养基规律完全一致；空载体阴性对照无信号（图1）；FBS添加浓度梯度实验，随血清比例升高30 kD完整条带灰度同步上升，总分泌蛋白提升2–3 倍（图2）；葡萄糖、甲醇不同碳源体系重复验证，各组菌体OD600无明显差异，证明分泌提升与菌体增殖无关，是FBS直接调控分泌通路（图3）。

37℃高温应激可模拟部分效应，但调控通路与FBS存在区别：37℃无血清培养组同样出现双条带，但质谱检测蛋白翻译后修饰位点、类型与FBS处理样品不同，两套调控机制相互独立。说明高温应激不能完全替代FBS的保护作用（图4）。

FBS保护效应依赖eGFP C端标签序列，不适用全部重组蛋白：SLPI蛋白添加FBS仅总分泌量上升，无新增高分子条带；b-FGF出现双条带，β-乳球蛋白无变化，证明效应存在蛋白特异性（图5）。

30 kD条带为完整带标签eGFP，26.8 kD是C端水解产物：IMAC亲和纯化结果显示30 kD条带可结合钴柱，抗c-myc抗体可检出；26.8 kD条带无法挂柱、无c-myc免疫信号，证实其丢失末端纯化标签。说明无FBS条件下大部分分泌蛋白在胞内转运时丢失标签，直接大幅降低下游亲和纯化收率（图6）。

FBS仅调控分泌通路，胞内表达蛋白不受影响：无分泌信号的胞内eGFP工程菌，无论是否添加FBS，胞内裂解液WB条带完全一致（图7）。证明FBS特异性调控内质网—高尔基体分泌转运通路，不改变胞内蛋白稳定性。

结论与展望

行业长期研发聚焦基因编辑、发酵工艺改造，忽略培养基小分子对分泌通路的调控作用。本研究证实仅添加FBS即可完整蛋白产量提升2–3倍，纯化损耗大幅下降，优化成本远低于菌株改造。后期建议采用“工程菌株改造 + 屠宰副产物无血清培养基”双向协同方案：一方面过表达SEC31加速蛋白转运；另一方面以牛内脏、血浆提取物复配培养基，双重抑制蛋白C端降解，实现低成本、高纯化收率规模化生产。目前，广东环凯微生物科技有限公司已有较为成熟的胎牛血清产品，价格理想且规格多样，已投放市场售卖的规格在50-500mL范围不等。

参考文献链接：https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2026.130966