鼠李糖乳杆菌可降低B族链球菌对Hela细胞的细胞毒性

　　研究背景：

　　阴道微生物在对性传播疾病和阴道感染的非特异性防御中起着重要作用。女性阴道微生态环境主要由不同种类的乳杆菌定植，乳杆菌在阴道微环境中起着重要的保护作用。乳杆菌通过分泌抗菌化合物和占据潜在的粘附位点以防止病原体的阴道定植。乳杆菌减少是阴道微生物组失衡的特征，与细菌性阴道炎和脱屑性炎症性阴道炎有关。

　　B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)是一种存在于约18%~40%健康人群阴道中的机会性病原体，GBS可导致新生儿和易感成人罹患严重疾病。先前的研究表明，阴道乳杆菌减少与GBS定植有关，乳杆菌益生菌补充剂可减少阴道GBS的定植，即乳杆菌与阴道GBS之间存在负相关关系，然而其具体机制仍未明确。围产期GBS感染是一个重要的临床问题，GBS可垂直传播给新生儿，导致新生儿罹患脓毒血症、脑膜炎和肺炎等不良疾病。GBS编码毒力以逃避宿主免疫系统并促进上行感染。

　　目前尚不清楚乳杆菌如何与GBS或GBS分泌物相互作用以调节其发病机制和阴道定植。宿主细胞依赖肌动蛋白细胞骨架发挥多种功能。细胞粘附、微绒毛和膜囊泡分泌依赖于肌动蛋白细胞骨架，细胞肌动蛋白的紊乱会干扰微绒毛的产生，微绒毛也可分泌囊泡。先前研究表明，GBS分泌的磷酸甘油酸激酶会破坏宿主细胞肌动蛋白并改变宿主细胞形态。因此，探索GBS对宿主宫颈上皮和细胞骨架的影响可为GBS定植的具体机制产生有价值的见解。

　　鼠李糖乳杆菌已被证明可减少病原体对上皮细胞的粘附并影响细胞因子分泌。目前，鼠李糖乳杆菌已应用于益生菌产品中，被认为可以减少孕妇的GBS感染，并可能改变阴道微生物组，作为细菌性阴道炎的补救措施，鼠李糖乳杆菌也可能调节宿主免疫应答。当前仍需更多的研究以阐明鼠李糖乳杆菌用于调节阴道中其他微生物活性的机制。

　　研究结果：

　　GBS以剂量依赖性方式引起HeLa细胞脱离

　　作者用0-1000MOI的GBS感染HeLa细胞4 h，发现与阳性对照(0 MOI)相比，随着GBS的MOI增加，可观察到更多的HeLa细胞分离(图1)。10、500、1000 MOI的GBS可导致HeLa细胞分离率增加2倍、8倍和8.5倍。作者选择了500和1000 MOI进行后续研究，以最大限度地研究GBS和鼠李糖乳杆菌对HeLa细胞的影响及细菌之间的相互作用。

　　图1 GBS引起HeLa细胞脱离

　　鼠李糖乳杆菌可防止GBS引起的HeLa细胞分离

　　GBS感染4 h后可引起HeLa细胞显著脱离，而接种鼠李糖乳杆菌后有所改善(图2)。1000 MOI GBS感染HeLa细胞时，可引起HeLa细胞大量脱离，500 MOI的GBS可引起较小但具有统计学意义的HeLa细胞脱离(p<0.001)(图2B)。而加入鼠李糖乳杆菌细胞悬浮液后，与阴性对照组相比，共接种后没有导致HeLa细胞的显著脱离(p=0.25)。结果表明，GBS以剂量依赖性方式引起HeLa细胞脱离，鼠李糖乳杆菌可抑制GBS依赖性HeLa细胞脱离。

　　作者进一步用GBS发酵上清液与HeLa细胞共培养，发现GBS发酵上清液也可引起HeLa细胞分离(图2B)。为进一步检查GBS侵袭和HeLa细胞裂解是单层细胞破坏的重要因素的可能性，作者进行了侵袭测定试验。结果表明，侵袭不是HeLa细胞分离的原因。

　　图2 鼠李糖乳杆菌抑制GBS依赖性HeLa细胞分离

　　HeLa细胞感染对细菌活力的影响

　　为确定细胞培养条件如何影响细菌，作者在培养箱中检查了DMEM+5% FBS中鼠李糖乳杆菌和GBS的生长情况。结果表明，两种细菌在上述条件下均可生长，GBS的生长速度高于鼠李糖乳杆菌的生长速度(图3A)。

　　为确定HeLa细胞如何潜在地影响实验中任一物种的生长，作者在琼脂平板上连续稀释和接种用1000 MOI细菌侵袭HeLa细胞4 h后的上清液，并在孵育24 h后测定CFU。结果表明，与已知的输入CFU相比，感染4 h后在上清液中回收的GBS多约2.9倍，仅回收了0.13 倍鼠李糖乳杆菌(图3B)。

　　在SEM实验中，与GBS相比，更多的鼠李糖乳杆菌在感染后粘附在HeLa细胞表面(图4)。因此，作者假设鼠李糖乳杆菌从HeLa细胞感染的上清液中回收率低收到鼠李糖乳杆菌对HeLa细胞高粘附性以及感染条件下较低的生长速率的影响(图3A)。

　　图3 鼠李糖乳杆菌(非GBS)的回收受到HeLa细胞的影响

　　图4 GBS导致HeLa细胞表面的微绒毛和膜囊泡丢失

　　扫描电子显微镜揭示了GBS对HeLa细胞微绒毛和分泌囊泡的细胞毒性作用

　　作者使用扫描电子显微镜(SEM)检查GBS感染后的HeLa细胞表面。研究表明，未暴露于细菌的HeLa细胞被微绒毛和膜囊泡覆盖，暴露于1000 MOI GBS的HeLa细胞呈现平滑的拓扑结构，微绒毛大大减少;仅暴露于鼠李糖乳杆菌的细胞显示出大量的囊泡和微绒毛;HeLa细胞共同暴露于GBS和鼠李糖乳杆菌时观察到中间表型，微绒毛和囊泡比仅暴露于GBS的细胞更丰富，当仍低于阴性对照或鼠李糖乳杆菌暴露HeLa细胞。作者认为，高浓度GBS会对HeLa细胞微绒毛和囊泡发生重大损害。

　　作者进一步分析HeLa细胞表面的囊泡(图5)。作者发现，HeLa细胞暴露于GBS后细胞囊泡变小，鼠李糖乳杆菌可改善上述情况(表1)。

　　图5 GBS减小了HeLa细胞微绒毛和膜囊泡的大小

　　表1 暴露于细菌4 h后HeLa细胞囊泡大小的描述性统计

　　GBS以剂量依赖性方式破坏HeLa细胞F-肌动蛋白

　　肌动蛋白在细胞形态和微绒毛结构中起重要作用，微绒毛依赖性是囊泡分泌的机制之一。作者假设HeLa细胞脱离、微绒毛消融和分泌囊泡大小的减少有关，因此，作者进一步探索GBS对HeLa细胞F-肌动蛋白的影响。研究发现，随着GBS的MOI增加，HeLa细胞的F-肌动蛋白破坏更明显(图6)。

　　图6 GBS MOI与HeLa细胞F-肌动蛋白破坏相关

　　鼠李糖乳杆菌抑制GBS引起的F-肌动蛋白降解

　　为确定GBS诱导的F-肌动蛋白破坏是否可以倍鼠李糖乳杆菌抑制，作者用GBS、鼠李糖乳杆菌分别/共同感染HeLa细胞，发现同时添加鼠李糖乳杆菌后未观察到GBS依赖性F-肌动蛋白破坏，共同感染的细胞显示出与对照组相似的F-肌动蛋白排列(图7)。

　　肌动蛋白染色实验与先前结果抑制，鼠李糖乳杆菌可抑制GBS引起的细胞毒性作用。

　　图7 GBS破坏和减少宿主细胞F-肌动蛋白

　　研究结论：

　　乳杆菌对维持健康的阴道微生物组具有重要作用，是益生菌产品中的重要物种。检查乳杆菌和GBS相互作用的研究对于了解阴道微生物组的细菌间相互作用非常重要。因此，在本研究中，作者试图探索鼠李糖乳杆菌用于保护宿主细胞免受GBS侵害的机制。

　　研究发现，鼠李糖乳杆菌可以保护宿主细胞免受GBS定植和细胞毒性的影响。鼠李糖乳杆菌保护宿主细胞免受F-肌动蛋白、微绒毛、分泌囊泡和细胞粘附的GBS依赖型破坏。然而，每种表型的依赖性和相互相关性仍未确定，需要进一步进行研究。了解控制GBS致病性的机制以及鼠李糖乳杆菌等共生细菌用以调节GBS的致病性机制对于了解孕妇的不良疾病具有重要意义。

　　参考文献：Cajulao J M, Chen L. Lactobacillus rhamnosus reduces the cytotoxic effects of group B streptococcus on HeLa cells[J]. Microb Pathog. 2021. 161(Pt A): 105271.DOI: 10.1016/j.micpath.2021.105271