黄酮类对乙醇诱导的肠屏障损伤的修复作用

2021年4月14日，南昌大学袁金文课题组在期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》上在线发表题为“Reparative Effects of Ethanol-Induced Intestinal Barrier Injury by Flavonoid Luteolin via MAPK/NF-κB/MLCK and Nrf2 Signaling  Pathways” 的研究性文章。通过细胞实验证明了木犀草素通过调节MAPK/NF-κB/ mlck介导的TJ通路和Keap1/ nrf2-ARE介导的抗氧化反应通路，修复被乙醇破坏的Caco -2细胞单层屏障功能。因此，木犀草素可作为治疗肠道屏障功能的膳食补充剂进行开发。

肠上皮是一种高度选择性的屏障，它允许从肠腔吸收营养物质进入循环，并限制有害化合物(如内毒素)的进入。上皮屏障功能是由邻近上皮细胞之间的紧密连接(TJs)控制的TJs具有一个复杂的由蛋白质组成的网络，包括occludin、claudin和连接粘附分子，通过zonulin occludin-1 (ZO-1)蛋白与肌动蛋白细胞骨架相互作用。这些蛋白对肠屏障的正常功能至关重要，并且容易受到一些应激源的影响，如酒精应激，这些应激源通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κ b (NF-κB)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)信号通路导致肠屏障损伤。木犀草素是一种膳食类黄酮，作为肠道保护剂已引起越来越多的关注。最近，使用功能性食品成分来预防肠道功能障碍的趋势越来越多。本研究旨在通过Caco-2细胞单层模型，探讨木犀草素对乙醇诱导的肠屏障损伤的修复作用及其可能的机制。

1.木犀草素对乙醇诱导细胞毒性的抑制作用

CCK-8法测定木犀草素对Caco-2细胞的细胞活力。用7.5%乙醇处理1 h，再用5、50、100 μmol/L木犀草素处理24 h，细胞活力无显著差异。7.5%乙醇处理导致LDH明显渗漏(p < 0.05)，而木犀草素显著抑制LDH浓度，且呈剂量依赖性。

2.木犀草素缓解乙醇诱导的氧化应激

采用HCA法测定Caco-2细胞中ROS的含量。细胞内ROS含量的图像如图所示，7.5%乙醇处理Caco-2细胞显著(p < 0.01)增加了ROS水平，木犀草素预处理可以以剂量依赖的方式消除ROS水平。

3.木犀草素对Caco-2单层肠上皮完整性的修复作用

评估木犀草素对乙醇处理的Caco-2单层肠上皮细胞的影响。与对照组相比，乙醇暴露显著降低了TEER值，犀草素能有效逆转； 5 ~ 100 μmol/L木犀草素处理不同程度地恢复了乙醇诱导的这些蛋白的脱位。WB结果如图所示，7.5%乙醇作用1 h后，细胞中ZO-1、occludin和claudin-1蛋白表达量分别降低37.27%、37.01和33.88，而5 ~ 100 μmol/L木犀草素作用1 h后，细胞中TJ蛋白表达量显著升高。在遗传水平，乙醇显著降低了ZO-1、occludin和claudin-1 mRNA的表达水平，木犀草素处理显著抑制了该下降。然而，所有三个木犀草素处理组的occludin水平都低于乙醇组，说明木犀草素对TJ的保护作用主要在转录后水平。

4.木犀草素抑制MAPK/NF-κB/ mlck介导的TJ功能障碍。

研究木犀草素对MAPK/NF-κB/MLCK信号通路改善肠道屏障的影响。如图所示，与对照组相比，乙醇诱导了包括p38、JNK和ERK在内的MAPKs磷酸化的增加。5 ~ 100 μmol/L木犀草素抑制P38磷酸化呈剂量依赖性，50 ~ 100 μmol/L木犀草素显著抑制ERK和JNK磷酸化。NF-κB分析显示，与对照组相比，乙醇处理显著诱导p65磷酸化和p65从细胞质向细胞核易位，木犀草素也显著抑制乙醇诱导的MLCK升高和MLC磷酸化。利用雷公藤甲素(一种NF-κB p65抑制剂)和ML7(一种MLCK抑制剂)分别测定NF-κB和MLCK在木黄素驱动的TJ表达中的关键作用。雷公藤甲素显著抑制MLCK下调和ZO-1升高， ML7直接抑制ZO-1表达。上述结果提示木犀草素可通过MAPK、NF-κB和MLCK信号通路缓解肠屏障功能障碍。

5.木犀草素调控nrf2介导的抗氧化反应。

当细胞先前被乙醇破坏时，与对照组相比，total-Nrf2、nuclear-Nrf2、Keap1和Nqo1蛋白表达量显著降低。免疫荧光结果显示乙醇处理显著抑制Nrf2从细胞质向细胞核的转运。而木犀草素处理后，乙醇引起的上述变化均有不同程度的缓解。因此，与对照组相比，乙醇组非酶促抗氧化剂(TGSH)水平和酶促抗氧化剂(TSOD)活性显著降低，而木犀草素处理能显著抑制乙醇诱导的T-SOD和T-SGH的降低。

6.nrf2介导的间接抗氧化对ROS和TJ蛋白的影响

采用选择性抑制剂ML385(一种Nrf2抑制剂)测定木犀草素间接抗氧化作用在TJ中的作用。如图所示，选择性抑制剂显著消除了木犀草素对乙醇诱导的ROS产生的抑制作用。此外，木犀草素诱导的Nqo1、ZO-1、occludin和claudin-1的表达被ML385(一种Nrf2抑制剂)显著抑制。

参考资料：黄酮类木犀草素通过MAPK/NF-κB/MLCK和Nrf2信号通路对乙醇诱导肠屏障损伤的修复作用