细菌诱导胶体包封-益生菌口服给药

背景：口服益生菌经常用于调节肠道微生物群，肠道微生物群在宿主健康中发挥着重要作用，并与胃肠道疾病、代谢和免疫有关。然而，益生菌在临床实践中的应用有限，因为其口服生物利用度低，这是由于胃肠道环境的恶劣影响和在胃肠道中的有限滞留造成的。益生菌封装技术是克服这些限制的最有前途的方法之一。

益生菌主要通过喷雾干燥或挤出技术与天然聚合物物理共混和被动负载到水凝胶或纳米涂层中，被封装在各种材料中。这种封装可以在一定程度上提高益生菌的口服生物利用度，但仍有一些障碍亟待解决。首先，水凝胶的多孔结构和组装的纳米涂层的纳米级厚度不能提供足够的抵抗氢离子在低pH胃酸或胆汁盐中在肠道中的扩散的能力。其次，常用胶囊材料的非粘附性导致益生菌在肠道表面的定植较差。第三，传统化学交联策略产生的密闭空间封装显著限制了益生菌的增殖。此外，封装技术的缺点，包括封装效率低、使用有害的交联剂以及繁琐和耗时的工艺，仍然需要克服。因此，开发一种方便高效的封装策略来增强益生菌的口服递送仍然是一个挑战。

在自然界中，细菌通过自身产生的细胞外基质（ECM）在细菌周围具有积极的保护机制。ECM具有数十微米的紧凑结构，赋予细菌对各种恶劣环境（包括极端pH和紫外线）的后天抵抗力。此外，ECM表现出促进细菌定殖的粘附特性，以及支持细菌持续增殖的自适应能力。在这里，为了模拟自产ECM的结构和功能特征，我们提出了一种细菌诱导的封装策略，通过组装亚稳胶体来提高益生菌的保护、定殖和增殖。

图1 益生菌口服给药的细菌诱导胶体包封的示意图。（a） 益生菌通过细菌诱导的胶体组装进行封装。（b） 在口服过程中，通过对胃酸的抵抗和胶囊益生菌的粘膜粘附增强生物利用度。

结果和讨论

细菌诱导组装NTc用于益生菌封装

通过PCD末端环氧基与二胺的开环反应合成了氨基改性PCD。选择三种二胺，包括乙二胺（EDA）、1,4-二氨基丁烷（DAB）和1,6-二氨基己烷（DAH），以调节具有相似化学性质但不同结构的氨基改性PCD。通过1H NMR和酸度滴定结果验证，三种二胺被成功地改性为PCD，并且几乎所有的环氧基都转化为氨基。得到的三种氨基修饰的PCD具有约+20 mV的正电荷，并含有丰富的环糊精空腔。前者可以为细菌提供静电吸引，同时屏蔽胃液中的氢离子扩散到细菌中，而后者可以提供宿主分子腔以与TA相互作用。

为了制备胶体，在室温下将EDA改性的PCD（NPCD）与TA溶液混合。然后形成NPCD-TA胶体（NTc），表现出明显的廷德尔效应。动态光散射（DLS）显示NTc的流体动力学直径为~30 nm（图2a）。此外，透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）也显示NTc的干收缩直径为~15nm（图2b）。此外，通过紫外-可见光谱和圆二色光谱研究了TA和NPCD之间的相互作用。与纯TA相比，NTc在紫外-可见光谱中显示出更宽的红移带，在圆二色光谱中276 nm处的正带减少，表明TA与NTc中的NPCD形成了络合物。

得益于负电荷诱导的NTc组装，NTc被应用于益生菌的封装。益生菌菌株大肠杆菌Nissle 1917（EcN）被广泛用于治疗肠道感染和肠道微生物群失调，被用于概念验证研究。一旦与NTc悬浮液接触，在没有任何其他处理的情况下，EcN在10秒内被快速封装（图2e）。所得混合物在600nm处变白且不透明，浊度增加（图2f），说明细菌诱导的NTc组装形成NTc包封的EcN（NTcEcN）。与传统的被动包封方法相比，细菌诱导的包封策略具有高效包封EcN（高达~97%）和高利用率（高达-91%）的优点，通过减去上清液中残留的NTc和EcN来计算。

为了观察在EcN周围形成的NTc壳，将SYTO 9-标记的EcN（绿色）加入TRITC标记的NTc（红色）悬浮液中，并在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下观察。3D共定位成像证实，EcN被包裹并均匀分布在NTc壳体内，整个晶粒尺寸约为16μm（图2g）。此外，TEM和扫描电子显微镜（SEM）均显示，NTc壳紧密地包围着EcN，在NTc壳和EcN之间没有可见的纳米间隙（图2h；图S12）。与先前报道的基于TA和金属离子（如Fe3⁺或Ca2⁺）的金属-酚配位的用于封装益生菌的纳米涂层相比，厚而紧凑的NTc外壳可以赋予益生菌更强的抗环境攻击能力。为了测试NTc外壳对封装的EcN的毒性，在Luria–Bertani（LB，pH 7.4）培养基中，通过600 nm（OD600）的光密度在37 °C下监测NTcEcN的生长行为。与裸EcN相比，NTcEcN显示出相似的生长速，表明细菌诱导的不含交联剂的NTc包封是无毒的，不会损害益生菌的生存能力。总体而言，无毒的NTc外壳具有紧凑的微观结构，并很好地模拟了细菌ECM的结构特征。

为了进一步研究细菌诱导的胶体组装机制，将带正电荷的ε-聚赖氨酸（PLL）包被的EcN（EcN-PLL，+27mV）和带负电荷的PLL/藻酸多糖（ALG）包被EcN（EcN-PLL/ALG，-26mV）加入NTc悬浮液中。浊度的增加只发生在含有EcN-PLL/ALG的NTc悬浮液中，而没有发生在含有EcN-PLL的NTc悬液中，这证实了只有带负电荷的EcN才能诱导NTc的主客体组装（图2f）。为了追踪带负电荷的EcN如何接触NTc并诱导组装，将TRITC标记的NTc悬浮液滴到EcN锚定的载玻片上。正如在CLSM下观察到的那样，EcN能够立即吸引大量的NTc包围EcN。总之，细菌诱导胶体组装的机制可以得出结论，带负电荷的EcN静电吸引带正电荷的NTc，并屏蔽静电排斥，以打破亚稳NTc的平衡。因此，主要的宿主-客体相互作用进一步触发了胶体组装成细菌周围的致密外壳，类似于细菌周围自行产生的ECM（图1a）。值得注意的是，由于主客体相互作用的动态、可自愈和自适应性质，所产生的NTc壳层是均匀的，没有可见的单个胶体（图2h）。此外，这种细菌诱导的胶体包封策略可以扩展到各种表面带负电荷的微生物，包括凝结芽孢杆菌（BC）、金黄色葡萄球菌（S.aureus），甚至真核酵母，这表明它的多功能性（图2i）。

图2 细菌诱导的NPCD/TA胶体（NTc）组装用于益生菌封装。（a） 通过DLS测量的TA、NPCD和NTc的尺寸分布和ζ电位值。（b） NTc的典型TEM图像。（c） NTc在DMSO-d6中的2D 1H–1H NOESY光谱。（d） TA/β-CD复合物的MD模拟。（e） 添加EcN前后NTc悬浮液的照片。（f） 在添加EcN、EcN-PLL或EcN-PLL/ALG之后，NTc悬浮液在600nm处产生浊度。（g） EcN和NTcEcN的3D CLSM图像。用SYTO 9（绿色）标记EcN，用TRITC（红色）标记NTc外壳。（h） NTcEcN的典型TEM图像和放大图像。（i） 在加入包括BC、金黄色葡萄球菌和酵母在内的各种微生物后，在600nm处产生浊度。

NTcEcN的体外环境抗性

胃的酸性环境（pH 1-2.5）使大多数益生菌失活，这是益生菌安全到达肠道的最大挑战。我们研究了NTc壳在模拟胃液（SGF，胃蛋白酶pH 2.0）中对EcN的保护作用。广泛应用于益生菌口服给药的商业肠道聚合物EUDRAGIT L100用于通过Ca2⁺离子诱导的交联包封EcN（L100EcN，粒度约23 μm）作为对照。暴露2小时后，没有任何包封的裸EcN在SGF中几乎无法存活（图3a）。然而，NTcEcN对SGF的抗性增强，存活率高达19%，是L100EcN的7500倍（图3a）。

我们进一步研究了为什么NTc外壳对益生菌表现出优异的酸性保护作用。首先，微米级NTc外壳在酸性条件下是稳定的（图S17），这提供了一个强大的穿透屏障，就像细菌自产的ECM一样。其次，外壳的正电荷可以有效地阻止H+离子向细菌细胞的扩散，帮助益生菌抵抗酸性攻击。此外，与多孔水凝胶不同，NTc壳结构紧凑。为了验证紧密性的重要性，通过改变TA与氨基修饰的PCDs的结合亲和力来调节主客体相互作用的强度。等温滴定量热法（ITC）结果显示，随着二胺改性PCD长度的增加，TA与二胺改质PCD的结合亲和力逐渐降低。因此，对胃酸的抵抗力受损，表明致密性与耐酸性呈正相关。因此，NTc壳层的致密厚结构和正电荷协同作用，以抵抗H⁺离子的攻击。

接下来，我们评估了NTc外壳是否可以保护益生菌免受肠道胆汁盐的影响，肠道胆汁盐通过溶解脂质杀死益生菌。暴露于4%胆汁盐2小时后，63%的NTcEcN存活，约为裸EcN或L100EcN的两倍（图3b）。这可能是由于NTc外壳结构紧凑而厚，有效地限制了胆汁盐向细菌细胞的扩散。此外，NTc外壳可以有效保护益生菌免受传统杀菌条件的影响，包括乙醇（30%，v/v）、过氧化氢（H₂O₂，8 mmol·L^–1）和254 nm的紫外线照射（图3c）。NTc外壳的广谱保护能力可能受益于NTc外壳在乙醇中的不溶性和自由基清除能力，以及NTc外壳中来自TA的高紫外线吸收系数。NTc外壳的这些保护特性为益生菌的日常使用提供了便利和优势。

NTcEcN在SIF中的增粘和持续增殖

 除了对胃酸的抵抗力外，益生菌在肠道中的粘附和定殖是提高益生菌生物利用度的下一个重大挑战。粘蛋白是肠道粘液层中的一种糖蛋白。益生菌与粘蛋白的强结合能力有利于它们在肠表面的粘附和定植。为了研究NTc外壳在益生菌粘附中的作用，我们评估了NTc和粘蛋白之间的结合亲和力。ITC结果显示，它们的结合常数（K）为1.2×105 L·mol^–1（图3d），比L100和粘蛋白之间的结合常数高约10倍。此外，为了观察粘蛋白对NTc与L100的结合偏好，我们在载玻片上制备了NTc膜和L100膜，以吸附TRITC标记的粘蛋白。将载玻片上的NTc膜和L100膜浸入含有TRITC粘蛋白（1 mg·mL–1）的模拟肠液（SIF）溶液中，并在37 °C下孵育1小时。NTc膜显示粘附粘蛋白的荧光强度比L100膜增加了近7倍（图3e），显示粘蛋白对NTc膜的吸附偏好。此外，为了研究NTc外壳是否在肠蠕动样流下增强益生菌的粘附，将NTcEcN逐滴流过粘蛋白涂层的载玻片。与裸EcN和L100 EcN的可忽略粘附性相反，NTcEcN大量粘附在粘蛋白表面，证明了NTcEcN对粘蛋白的非凡粘附能力（图3f）。这种强大的粘附能力可归因于NTc壳中TA组分通过多种相互作用（包括氢键、疏水和离子相互作用）的高粘蛋白结合亲和力。

为了进一步研究NTcEcN的增殖活性，将NTcEcN在37 °C的SIF中孵育。NTcEcN在SIF中的增殖活性与裸EcN的增殖活性相当，通过它们相似的生长曲线和平板计数验证（图3g，h）。这些结果表明，NTcEcN在密闭空间中仍然保持着分裂和增殖活性。此外，在TEM下观察到细菌分裂过程中NTc外壳的典型动态重塑（图3i）。因此，与其他共价交联材料不同，由于主客体相互作用的动态非共价和自适应性质，NTc壳为EcN的生长和分裂提供了动态重塑微环境。总体而言，NTc外壳不仅对粘蛋白表现出较强的粘附特性，而且支持细菌的持续增殖，从而很好地模拟了细菌ECM的功能特征。

图3  EcN诱导的胶体包封在模拟肠液（SIF，pH 6.8，胰蛋白酶）中抵抗环境攻击、粘膜粘附和持续增殖。（a–c）暴露于（a）模拟胃液（SGF，胃蛋白酶pH 2.0）、（b）4%胆汁盐2小时和（c）常规灭菌条件1小时后，通过平板计数法评估NTcEcN、裸EcN和L100EcN的存活率，包括乙醇（30%，v/v）、过氧化氢（H₂O₂，8 mmol L–1）和254 nm的紫外线照射。（d） L100或NTc与粘蛋白在25°C下的等温滴定量热法（ITC）曲线。（e） 粘附在L100膜和NTc膜上的TRITC标记的粘蛋白（红色）的荧光强度和图像。（f） 粘附在粘蛋白涂层载玻片上的EcN、L100EcN和NTcEcN的示意图和荧光图像。EcN和包封的EcN逐滴流过涂有粘蛋白的载玻片以模拟肠蠕动样流动。用SYTO 9（绿色）标记EcN。（g） 在37 °C的SIF中培养的EcN和NTcEcN（2×108CFU）的生长曲线。OD600使用微孔板读数器进行监测。（h） 在37°C的SIF中培养0、1、2、4和6小时后，通过平板计数法对EcN和NTcEcN（2×108CFU）进行细菌计数。通过Student t检验计算统计学意义（**p<0.01、***p<0.001和***p<0.01）。

NTcEcN增强小鼠口服生物利用度和生物安全性

接下来，从四个方面验证了NTcEcN在啮齿类动物模型中的适用性：粘膜粘附性、对胃酸的抵抗力、口服生物利用度和生物安全性。首先，通过灌胃给小鼠施用1×108CFU的用SYTO 9标记的EcN或NTcEcN（图4a），并在灌胃后4小时在体内成像系统（IVIS）下观察。与裸EcN的较少保留相比，大量的NTcEcN保留在小鼠的胃肠道中，表明NTcEcN在体内的粘膜粘附能力增强（图4b）。其次，为了验证NTcEcN在通过胃酸后的生存能力，通过灌胃给小鼠施用EcN和NTcEcN，随后在灌胃后4、48和96小时处死小鼠。从胃肠道的不同区域（从胃到结肠）收获的活EcN或NTcEcN的数量通过用庆大霉素在LB琼脂上的平板计数来计数。灌胃后4小时，盲肠和结肠组织中粘附的NTcEcN分别是裸EcN的9.8倍和6.2倍（图4c），显示出NTcEcN对胃酸的强大抵抗力。NTcEcN在胃肠道中的强粘附保持长达96小时（图4c-f）。第三，NTcEcN的口服生物利用度（保留在胃肠道中的EcN总量与口服剂量的比率）高达31%，几乎是裸EcN的5倍（图4g）。最后，系统评价了NTcEcN的口腔生物安全性。对Caco-2和HT-29结肠癌细胞系的细胞毒性测定表明，NTc在体外NTcEcN中具有良好的细胞相容性（图S21）。经口灌胃NTcEcN后第7天，小鼠的血清细胞因子和组织病理学评估显示，体内NTcEcN未引起明显的炎症反应（图4h-j）、组织学损伤或病理变化（图4k，l）。上述结果表明，NTcEcN是一种安全的生物制剂，具有显著的优点，包括优异的粘膜粘附性、改善的对胃酸的抵抗力和提高的口服生物利用度。

图4  NTcEcN在小鼠体内的口服生物利用度和生物安全性。（a） 在小鼠模型中评估口服生物利用度的实验设计。处死小鼠，并在灌胃1×108CFU的EcN或NTcEcN后4、48和96小时收获胃肠道（从胃到结肠）。在37 °C下培养24小时后，通过平板计数法对每条道中的EcN或NTcEcN的量进行计数。（b） 小鼠的典型IVIS图像和经口灌胃用SYTO 9标记的EcN或NTcEcN后4小时的总荧光强度。（c–e）在（c）4小时、（d）48小时和（e）96小时时胃、小肠、盲肠和结肠组织中粘附的EcN或NTcEcN的量。处死小鼠，并在灌胃1×108 CFU的EcN或NTcEcN后第7天采集血液、主要器官和肠组织。使用PBS作为对照。血清中典型细胞因子的水平，包括（h）IL-6、（i）IFN-γ和（j）TNF-α。（k） 结肠组织的组织病理学评分。（l） 肠组织H&E染色的典型图像。所有数据均显示为平均值±SD。通过Student t检验计算统计学意义（NS，不显著；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和***p<0.0001）。

NTcEcN治疗STm诱导的结肠炎小鼠模型

据报道，EcN通过分泌微蛋白或清除铁的铁载体来抑制肠道病原体并减少肠道细菌华。在此，建立了鼠伤寒沙门氏菌（STm）诱导的结肠炎小鼠模型，并在STm感染后第2天和第4天通过灌胃给予NTcEcN以治疗结肠炎小鼠，而PBS、纯NTc和裸EcN则通过灌胃给药作为对照（图5a）。在STm感染后第7天处死小鼠，并监测小鼠的STm量、结肠炎临床参数和肠道微生物群，以评估NTcEcN对STm感染的治疗效果。首先，在STm感染后的第7天，用NTcEcN处理导致小鼠粪便中的STm持续减少，与用PBS处理相比，STm减少了118倍（图5b）。此外，用NTcEcN处理的小鼠粪便中的EcN/STm比例从最初的9增加到76，是用裸EcN处理小鼠的12倍。在STm感染后第7天，在用NTcEcN处理的小鼠的肠道组织和内容物中也观察到类似的趋势。其次，我们发现，与PBS、纯NTc和裸EcN治疗相比，NTcEcN治疗显著改善了疾病参数，包括体重减轻、结肠缩短、炎症反应和肠道组织病理学损伤（图5c-j）。最后，我们评估了NTcEcN在调节结肠炎小鼠肠道微生物群方面的功效。NTcEcN治疗很好地重塑了结肠炎小鼠肠道微生物群的多样性（图5k），并恢复了与正常小鼠相当的丰富度和相对丰度（图5l）。重要的是，NTcEcN治疗显著降低了炎症性疾病相关变形杆菌和次级经典病原体（如大肠杆菌志贺菌和沙门氏菌）的丰度（图5m，n）。所有这些结果证明了NTcEcN在治疗STm诱导的结肠炎小鼠中的显著疗效。此前的许多研究也表明，通过口服小分子药物治疗结肠炎是有前景的。然而，NTcEcN在治疗某些胃肠道疾病和调节肠道微生物群方面可能具有相当大的优势，同时避免了长期使用这些小分子药物引起的全身副作用和并发症。

图5 NTcEcN对STm诱导的结肠炎小鼠模型的治疗。（a） 建立和治疗STm诱导的结肠炎小鼠模型的实验设计。小鼠在感染前1天用链霉素（100μL，200 mg mL–1）经口灌胃1×109 CFU的STm处理，然后在感染STm后第2天和第4天用PBS、NTc或1×109CFU的EcN或NTcEcN处理。在STm感染后第7天处死小鼠，并收集相关样品。使用正常小鼠作为对照。（b） STm感染后第1、3、5和7天小鼠粪便中STm的量。（c） STm感染后第7天小鼠的体重减轻和（d）结肠长度。（e） STm感染后第7天收集的小鼠结肠组织的照片。（f） STm感染后第7天小鼠结肠组织的典型H&E染色图像（黑色箭头：粘膜上皮细胞脱落，黄色箭头：炎症细胞浸润，绿色箭头：腺体杯状细胞减少）。（g） STm感染后第7天小鼠结肠组织的组织病理学评分。（h–j）STm感染后第7天，小鼠血清中典型细胞因子的水平，包括（f）IL-6、（g）IFN-γ和（h）TNF-α。（k–n）肠道微生物群分析（k）OUT水平上的主坐标分析（PCoA），（l）门水平上的群落热图，以及STm感染后第7天（m）大肠杆菌志贺菌和（n）沙门氏菌的相对丰度。所有数据均显示为平均值±SD。（c–e，g–j）通过Student t检验计算统计显著性。（m，n）通过Mann–Whitney–Wilcoxon检验计算统计学意义（NS，不显著；*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和***p<0.0001）。

结论

总之，我们提出了一种通过细菌诱导的胶体组装进行益生菌口服递送的封装策略。核心胶体材料（NTc）是由NPCD和TA通过主客体相互作用形成的。通过一步混合，不使用有害的交联剂，NTc在10秒内迅速组装成益生菌周围的外壳，包封率高达97%。值得注意的是，NTc外壳很好地模拟了细菌ECM的结构和功能特征。紧凑、厚且带正电的NTc外壳协同赋予EcN对SGF的强大抵抗力，存活率高达19%。此外，TA在NTc壳中的强粘附性增强了EcN的粘膜粘附和持久的肠道定植，而NTc壳的自适应宿主-客体相互作用支持了EcN在SIF中的持续增殖。体内实验证实了口服生物利用度和口服生物安全性，以及NTcEcN对结肠炎模型小鼠的显著治疗效果。作为一种方便高效的封装技术，这种细菌诱导的胶体组装策略可以扩展到各种微生物，从而为设计用于治疗各种疾病的微生物生物试剂提供了一种很有前途的口服递送系统。  

参考来源：Zhang C, Gao XR, Ren XX, et al. Bacteria-induced colloidal encapsulation for probiotic oral delivery [J]. ACS Nano, 2023, 17, 7, 6886–6898.