香菇多糖如何守护缺血肝脏？新机制揭示：肠道菌群 - IsoUDCA-Nur77 轴阻断巨噬细胞炎症

肝缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury, HIRI）是肝移植、肝肿瘤切除、创伤及休克后常见的临床难题，可导致术后肝功能障碍、移植肝原发性无功能甚至肝功能衰竭。尽管学界对HIRI的病理机制（如炎症反应、氧化应激）已有较多认知，但仍缺乏有效的预防和治疗手段。其中，炎症反应是HIRI的核心驱动因素，而巨噬细胞作为启动和放大炎症级联反应的关键细胞，被认为是潜在治疗靶点。在众多具有抗炎、保肝活性的天然产物中，香菇多糖（Lentinan, LNT）——一种源自香菇菌丝体的多糖，已被证实可改善非酒精性脂肪肝、酒精性肝损伤等疾病，但其在HIRI中的作用及机制尚未明确。2025年2月南方医科大学南方医院曾振华/陈仲清教授团队发表于International Journal of Biological Macromolecules（中科院1区，IF 8.5）的一项研究“Lentinan enhances microbiota-derived isoursodeoxycholic acid levels to alleviate hepatic ischemia-reperfusion injury in mice”，通过多组学结合分子生物学实验，首次揭示了LNT通过“肠道菌群-次级胆汁酸（Isoursodeoxycholic Acid, IsoUDCA）-Nur77”轴抑制巨噬细胞炎症，从而缓解HIRI的全新机制，为HIRI的预防提供了新的理论依据和潜在靶点。

研究设计：多维度验证 LNT 的保护作用及机制

为明确 LNT 对 HIRI 的作用，研究团队以 6-8 周龄 C57BL/6J 雄性小鼠为研究对象，构建了经典的 HIRI 模型：通过中位 laparotomy 结扎小鼠肝左叶和中叶血管 1.5 小时（缺血期），随后恢复血流 12 小时（再灌注期）；假手术组仅暴露肝门而不结扎血管。干预方案分为口服 LNT 组（100 mg/kg/ 天，连续 7 天）、IsoUDCA 组（50 mg/kg，术前 1 小时灌胃），同时设置 PBS / 油剂对照组。

1. 口服LNT显著减轻小鼠HIRI损伤

与HIRI+PBS组相比，口服LNT的小鼠肝组织病理损伤明显改善——H&E染色显示肝细胞坏死区域缩小、肝小叶结构更完整（Suzuki评分从约8分降至4分以下，图1c）；TUNEL染色显示凋亡细胞数量显著减少（图1d）；同时，反映肝功能的血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平下降约50%（图1e）。

同时，转录组分析进一步揭示，LNT可显著下调肝组织中与炎症相关的通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、趋化因子信号通路（图1i），且qPCR验证显示炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和趋化因子（Cxcl-1、Cxcl-2）的mRNA水平均显著降低（图1j）。这些结果表明，LNT的保肝作用与抑制肝脏炎症密切相关。

图1 口服LNT可减轻HIRI小鼠的肝损伤与炎症

（a）动物实验策略示意图。（b）小鼠肝脏形态代表性图像。（c）基于H&E染色的肝脏组织病理学评分，损伤区域以虚线标注（n=3–5）。（d）每个样本中的TUNEL阳性细胞平均数量（n=3–6）。（e）血浆ALT与AST水平（n=5–10）。（f）小鼠肝脏差异表达基因热图分析。（g）小鼠肝脏基因表达PCA分析图（n=4）。（h）差异表达基因火山图（P<0.05，Log2倍变化>2）。（i）下调差异表达基因的KEGG通路富集分析。（j）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=8–9）。

2. LNT的保护作用依赖肠道菌群

为探究LNT抗炎保肝的上游机制，研究团队首先排除了LNT直接作用的可能性：当通过腹腔注射给予LNT时，其对HIRI的保护效果完全消失（肝病理、ALT/AST及炎症因子水平与对照组无差异，图2a-e）。进一步用抗生素鸡尾酒（万古霉素、新霉素等）耗竭小鼠肠道菌群后，口服LNT也无法减轻HIRI损伤（图2f-i）；而将“LNT处理小鼠的粪便”移植给菌群耗竭小鼠（FMT）后，受体小鼠的HIRI损伤显著缓解（图2j-m）。这些实验明确证明：肠道菌群是LNT发挥HIRI保护作用的必要条件。

图2 LNT对HIRI的保护作用依赖于肠道菌群

（a）动物实验策略示意图。（b）小鼠肝脏形态代表性图像。（c）基于H&E染色的肝脏组织病理学评分（n=3–4）。（d）血浆ALT与AST水平（n=5–8）。（e）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=6–8）。（f）小鼠肠道菌群清除实验示意图（通过抗生素处理）。（g）肝脏组织H&E染色及组织病理学评分代表性图像，损伤区域以虚线标注（n=5）。（h）血浆ALT与AST水平（n=9）。（i）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=8）。（j）FMT（粪菌移植）实验策略示意图。（k）肝脏组织H&E染色及组织病理学评分代表性图像，损伤区域以虚线标注（n=5）。（l）血浆ALT与AST水平（n=7）。（m）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=12）。

3. LNT通过菌群调控关键代谢物IsoUDCA

肠道菌群的作用常通过代谢物介导，因此研究通过非靶向代谢组分析小鼠粪便样本，发现HIRI+LNT组与对照组相比，有75种代谢物上调、55种下调，其中IsoUDCA（一种肠道菌群衍生的次级胆汁酸）的上调倍数最高（图3c-e）。靶向检测进一步证实：口服LNT使小鼠粪便和血浆中IsoUDCA水平翻倍（图3f-g），而抗生素耗竭菌群后，LNT对IsoUDCA的上调作用消失；FMT实验则显示，移植LNT组小鼠粪便可恢复受体小鼠的IsoUDCA水平（图3h）。

更重要的是，单独给予IsoUDCA（50 mg/kg）可达到与LNT相似的保护效果：小鼠肝病理损伤减轻、ALT/AST降低、肝脏炎症因子减少（图3j-l）。这表明，IsoUDCA是LNT通过肠道菌群调控的关键效应分子。

图3 LNT促进肠道菌群衍生IsoUDCA的生成

（a）基于小鼠粪便代谢物矩阵的OPLS-DA分析（n=10）。（b）HIRI+PBS组与HIRI+LNT组代谢组学分析的火山图（n=10）。（c）HIRI+PBS组与HIRI+LNT组差异代谢物的柱状图（n=10）。（d）IsoUDCA的分子式。（e）HIRI+PBS组与HIRI+LNT组中IsoUDCA的相对丰度（n=10）。（f）通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对小鼠粪便中IsoUDCA浓度的绝对定量（n=8）。（g）小鼠血浆中IsoUDCA浓度的绝对定量（n=8）。（h）肠道菌群清除后，经LNT灌胃或粪菌移植的小鼠粪便中IsoUDCA浓度的绝对定量（n=5–11）。（i）口服50 mg/kg IsoUDCA后小鼠粪便中IsoUDCA水平的绝对定量（n=5）。（j）小鼠肝脏形态代表性图像，肝脏损伤程度通过组织病理学评分确定（n=3–5）。（k）血浆ALT与AST水平（n=3–8）。（l）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=4–8）。

4. IsoUDCA通过抑制巨噬细胞炎症发挥作用

既然IsoUDCA是核心效应分子，其作用靶点何在？研究聚焦于HIRI中的关键炎症细胞——巨噬细胞：

（1）在体外实验中，IsoUDCA（100 μM）可显著抑制脂多糖（LPS）刺激的枯否细胞（肝脏驻留巨噬细胞）和RAW264.7巨噬细胞中TNF-α、IL-6等炎症因子的表达（图4a-b），但对中性粒细胞的炎症反应无影响；

（2）在体内，从IsoUDCA处理的HIRI小鼠中分离的枯否细胞，其炎症因子水平显著低于对照组（图4c-d）；

（3）当用CL lipo（氯磷酸盐脂质体，一种用于清除巨噬细胞的工具，主要通过诱导巨噬细胞凋亡实现功能抑制）耗竭小鼠巨噬细胞后，IsoUDCA对HIRI的保护效果完全消失（图4e-i）。

这些结果清晰表明：IsoUDCA的保肝作用依赖于抑制巨噬细胞炎症。

图4 IsoUDCA通过抑制巨噬细胞炎症改善小鼠HIRI损伤

（a）LPS刺激6小时后Kupffer细胞中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=5-6）。（b）LPS刺激6小时后RAW 264.7细胞中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=5-6）。（c）从HIRI+Oil和HIRI+IsoUDCA小鼠肝脏中分离Kupffer细胞的示意图。（d）从HIRI+Oil和HIRI+IsoUDCA小鼠肝脏分离的Kupffer细胞中促炎细胞因子的qPCR检测结果（n=8-9）。（e）巨噬细胞清除实验示意图。（f）肝脏组织F4/80免疫组化染色代表性图像及每样本10个随机视野中F4/80阳性细胞平均数量计算（n=4）。（g）肝脏组织H&E染色及组织病理学评分，损伤区域以虚线标注（n=4）。（h）血浆ALT与AST水平（n=9）。（i）肝脏组织中促炎细胞因子与趋化因子的qPCR检测结果（n=5-8）。

5. IsoUDCA通过结合激活Nur77抑制NF-κB通路

最后，研究深入解析了IsoUDCA调控巨噬细胞炎症的分子机制：

（1）通过DARTS实验发现，IsoUDCA可保护一种约70 kDa的蛋白免受蛋白酶降解（图5a），结合蛋白分子量及炎症相关核受体数据库，锁定转录因子Nur77（分子量约70 kDa，参与免疫调节）；

（2）CETSA实验进一步证实，IsoUDCA可显著提高Nur77的热稳定性（图5c），分子对接显示IsoUDCA可结合Nur77的配体结合域（LBD），对接评分达-5.373（图5d），证明两者存在直接相互作用；

（3）机制上，IsoUDCA可降低Nur77的Ser351磷酸化水平（激活Nur77），进而抑制NF-κB通路激活——表现为P65核转位减少、P-P65和P-IκB（NF-κB通路激活标志物）水平降低（图5f-j）；

（4）当用siRNA敲低Nur77后，IsoUDCA对巨噬细胞NF-κB通路的抑制作用及抗炎效果完全消失，且其对肝细胞凋亡的保护作用（上调Bcl-2、下调Bax）也被阻断（图5k-m）。

图5 IsoUDCA通过结合并激活Nur77抑制巨噬细胞炎症信号通路

（a）DARTs实验中收集的RAW 264.7细胞总蛋白考马斯亮蓝染色分析。（b）DARTs实验中提取的Kupffer细胞和RAW 264.7细胞蛋白裂解液中Nur77蛋白表达水平（n=3）。（c）CETSA实验蛋白裂解液中Nur77蛋白表达水平（n=5）。（d）Nur77-LBD晶体结构与IsoUDCA对接示意图。（e）Western blot检测的Nur77蛋白磷酸化水平，经Nur77标准化（n=3）。（f）Western blot检测的细胞质和细胞核裂解液中P65蛋白表达水平（n=3）。（g）细胞质和细胞核裂解液中P65蛋白水平的定量分析（n=3）。（h）RAW 264.7细胞中P-P65和P-IκB水平的代表性免疫印迹条带（n=3）。（i）经P65标准化的P-P65水平柱状图（n=3）。（j）经IκB标准化的P-IκB水平柱状图（n=3）。（k）LPS刺激6小时后，RAW 264.7细胞中促炎细胞因子的相对mRNA水平（qPCR检测）（n=4-6）。（l）Kupffer细胞条件培养基刺激12小时后肝细胞中Bax和Bcl2蛋白水平的代表性图像。（m）肝细胞中Bax和Bcl2的表达水平，经Gapdh标准化（n=3）。

至此，研究完整揭示了LNT缓解HIRI的机制链：口服LNT→调节肠道菌群（如Allobaculum富集）→促进菌群产生IsoUDCA→IsoUDCA结合激活巨噬细胞中的Nur77→抑制NF-κB通路→减轻肝脏炎症及损伤（图6）。

图6 小鼠口服LNT缓解HIRI的分子机制

6. 从基础研究到潜在转化

该研究首次发现“LNT-肠道菌群-IsoUDCA-Nur77”轴在HIRI中的作用，为HIRI的预防提供了多维度的理论支持，也为天然多糖的抗炎机制研究及肠道菌群代谢物的功能挖掘提供了重要参考。

（1）机制创新：将天然多糖（LNT）、肠道菌群、次级胆汁酸（IsoUDCA）与核受体（Nur77）关联，拓展了HIRI病理机制的认知，也为“肠道-肝脏轴”在肝损伤中的作用提供了新证据；

（2）临床转化潜力：LNT已被用于癌症辅助治疗，安全性明确；而IsoUDCA在临床上用于治疗原发性胆汁性胆管炎，耐受性良好。两者均具备向HIRI预防转化的基础，尤其适合肝移植术前预防性给药；

（3）局限性与未来方向：研究仅验证了LNT的预防性作用，未探索其对已发生HIRI的治疗效果；且基于小鼠模型，需在大动物及人体中进一步验证。此外，LNT如何具体调控菌群产生IsoUDCA（如是否通过促进特定细菌的胆汁酸异构酶表达）仍需深入研究。

 原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.140717