多组学揭示哈茨木霉侵染导致双孢蘑菇软化的分子机制

双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是全球栽培广、商业价值高的食用菌，但组织娇嫩且无明显保护层，采后易软化褐变，直接降低商业和食用价值。其细胞壁成分独特，以葡聚糖（β-1,3、β-1,6 葡聚糖）、几丁质为主，与果蔬（纤维素、果胶为主）的软化机制不同。病原菌侵染是双孢蘑菇软化的重要外源因素，其中哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可引发严重病害，但目前其致软化的分子和代谢机制尚未明确。

西南大学曾凯芳团队在国际期刊 Journal of Food Microbiology （Q1，IF5.2）发表题为《Transcriptomics and metabolomics provide insights into the mechanisms of softening in Agaricus bisporus due to infestation by Trichoderma harzianum》研究性文章。

从自然软化的双孢蘑菇病部取样，经研磨匀浆→10 倍梯度稀释→接种 PDA 培养基（25℃培养 7 天）→纯化单菌落；提取菌株 DNA 后，用 ITS 基因通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATATGC）进行 PCR 扩增，测序结果与 NCBI 数据库比对，显示与哈茨木霉（Trichoderma harzianum）同源性达 99%，故命名为哈茨木霉 F1（T. harzianum F1）。

致病性验证：在双孢蘑菇帽表面制作 2 个 3×3mm 伤口，实验组每个伤口接种 10μL 1×10⁶ CFU/mL 的哈氏木霉 F1 孢子悬液，对照组接种无菌水；25℃存储 3 天观察，结果显示感染 2 天接种部位塌陷腐烂，3 天严重软化并产生绿色孢子，且硬度显著低于对照组，证实该菌株可导致双孢蘑菇严重软化。

图 1. 哈茨木霉 F1 的菌落形态（A）；注射哈氏木霉 F1 处理后双孢蘑菇的表型，注射部位用红色箭头标记，软化部位用红色圆圈标记（B）；哈氏木霉 F1 侵染后双孢蘑菇的硬度变化（C），竖线代表标准差，每组实验设 3 个生物学重复，* 表示 P<0.05，** 表示 P<0.01；哈氏木霉 F1 菌株进化树的构建（D）。

代谢组学分析结果：差异代谢物数量：共鉴定出703 个 DAMs，其中 297 个显著积累，406 个显著减少（图 2A）。代谢物分类：主要富集于氨基酸及其衍生物（113 个，33 个上调、80 个下调）、脂质（98 个，64 个上调、34 个下调）、黄酮类（96 个，12 个上调、84 个下调）、生物碱（85 个，31 个上调、54 个下调） （图 2D）。通路富集：KEGG 富集显示，碳代谢、TCA 循环、乙醛酸和二羧酸代谢、氧化磷酸化等能量代谢通路显著富集，同时细胞壁代谢相关通路（戊糖和葡萄糖醛酸互变、淀粉和蔗糖代谢）也被富集（图 2C）。

图 2. 对受哈茨木霉 F1 侵染的蘑菇进行广泛靶向代谢组学分析。差异积累代谢物（DAMs）的火山图（A）、主成分分析图（B）、DAMs 富集通路的散点图（C）以及 DAMs 的生化分类（D）。

转录组学分析结果：差异基因数量：感染 2 天样本中，共检测到1616 个 DEGs，其中 1149 个显著上调，467 个显著下调（图 3A）。功能富集：GO 富集：生物过程（BP）主要富集于 “细胞过程”“代谢过程”；细胞组分（CC）富集于 “细胞解剖实体”“含蛋白质复合物”；分子功能（MF）富集于 “催化活性”“结合活性”（图 3C）。KEGG 富集：能量代谢通路（TCA 循环、碳代谢）、细胞壁代谢通路、类固醇生物合成、次生代谢物生物合成等显著富集，与代谢组结果一致（图 3B）。

图 3. 哈茨木霉 F1 侵染后蘑菇的转录组分析。差异表达基因（DEGs）的火山图（A）、DEGs 通路富集的 KEGG 散点图（B）以及 DEGs 富集的 GO 通路图（C）。

对细胞壁降解酶与编码基因分析酶活性变化：几丁质酶：感染期间活性 “升 - 降” 波动，2 天达峰值，显著高于对照组；纤维素酶：前期平稳，3 天显著升高；β-1,3 葡聚糖酶：1-2 天与对照组无差异，3 天显著升高（图 4A-C）。

编码基因表达：RT-qPCR 验证显示，几丁质酶编码基因 AbChiA、AbChiA1，β-1,3 葡聚糖酶编码基因 Abexg3、AbexgD在感染 2-3 天显著上调；纤维素酶编码基因 AbCel3 呈下调趋势，与酶活性变化基本一致（图 5）。

图 4. 哈茨木霉 F1（T. harzianum F1）侵染后双孢蘑菇（A. bisporus）体内几丁质酶（A）、纤维素酶（B）及 β-1,3 葡聚糖酶（C）的活性变化。竖线代表标准差，每组实验设置 3 个生物学重复。* 表示 P<0.05（差异显著），** 表示 P<0.01（差异极显著）。

图 5. AbChiA1、AbChiA、AbSgl、AbCHS1、AbexgD 和 Abexg3 基因的表达水平。各基因在不同时间点的转录水平以 0 天（设为 1）为参照进行相对定量。

基因 - 代谢物关联分析（WGCNA）。模块划分：通过 WGCNA 将 DEGs 分为 5 个模块，其中turquoise 模块与 5 个软化相关代谢物（Phe-Arg-Tyr、肉桂酰甘氨酸、2 - 羟基 - 3 - 苯基丙酸、甲基 - 3-(3 - 羟基苯基) 丙酸、LysoPC 18:3 (2n 异构体)）呈高正相关（相关系数 > 0.9，P<0.05）（图 6B）。核心关联：甲基 - 3-(3 - 羟基苯基) 丙酸位于关联网络中心，与 271 个 DEGs 正相关；LysoPC 18:3 (2n 异构体) 与 104 个 DEGs 正相关，且 AbexgD 可能参与其代谢调控（图 7）。

图 6. 共表达网络分析。加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示的 5 个共表达基因模块的层次聚类树（A）；模块与性状的关联关系（B）。每行代表一个模块，左侧标注每个模块中的基因数量；每列代表一种特定性状，包括苯丙氨酸 - 精氨酸 - 酪氨酸（Phe-Arg-Tyr）、肉桂酰甘氨酸（Cinnamoylglycine）、2 - 羟基 - 3 - 苯基丙酸（2-Hydroxy-3-phenylpropanoic acid）、甲基 - 3-（3 - 羟基苯基）丙酸（Methyl-3-(3-hydroxyphenyl) Propionate）和溶血磷脂酰胆碱 18:3（2n 异构体）（LysoPC 18:3 (2n isomer)）。行与列交叉处每个单元格中的数值代表该模块与对应特定性状的相关系数，依据右侧色标进行展示；每个单元格括号内的数值代表 P 值。

图 7. 基因表达量与代谢物丰度的相关性网络图。红色圆点代表差异表达基因（DEGs），绿色圆点代表差异表达代谢物（DEMs）。

结论：

哈茨木霉 F1 通过两个关键途径导致双孢蘑菇软化：① 上调几丁质酶、纤维素酶、β-1,3 葡聚糖酶的活性及编码基因（AbChiA、AbChiA1、Abexg3、AbexgD） ，加速细胞壁降解；② 激活能量代谢通路（如 TCA 循环、碳代谢） ，为软化过程提供能量，同时特定差异代谢物（如 2 - 羟基 - 3 - 苯基丙酸）可能参与调控。但软化是动态过程，需进一步通过多时间点监测，明确关键基因和代谢物的动态变化规律。该首次明确哈茨木霉 F1 致双孢蘑菇软化的分子机制，鉴定出关键基因和代谢物，为开发双孢蘑菇采后保鲜技术（如抑制细胞壁降解酶活性、调控能量代谢）提供理论依据。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2025.111414