靶向调节葡萄糖激酶GK的灵芝降血糖多糖F31

研发意义

2019年全世界有4.63亿（9.3%）糖尿病患者，到2045年，预计增加到7亿（10.9%），全球医疗保健支出预计增加到9580亿美元，因此，糖尿病引起的死亡和医疗支出在世界范围内造成了巨大的社会、金融和卫生系统负担（Cho N. H., et al., 2018;A, P. S., et al., 2019）。目前中国的糖尿病患者居全世界首位（A, P. S., et al., 2019）。

糖代谢的稳态失衡，致使血糖无法维持正常生理波动范围，是Ⅱ型糖尿病(T2DM)的病理生理基础，因此保持血糖稳态（即血糖平衡）是保证我们人体糖代谢健康运转的核心因素（Petersen M.C., et al., 2017）。

葡萄糖激酶（Glucokinase, GK）作为葡萄糖传感器，主要表达于肝细胞(99%)和胰岛细胞（1%）。在肝细胞中，随着血浆葡萄糖浓度的升高，在胰岛素的刺激下，GK调节肝脏葡萄糖的吸收和帮助餐后血糖转变为糖原贮存在体内（Matschinsky F. M. and Wilson D. F., 2019），其生物学功能在血糖稳态的维持过程中发挥至关重要作用（Lei, L., et al., 2018）。

虽然GK已成为治疗糖尿病很有前景的药物研究靶点，但目前还没有靶向GK的此类药物上市。目前用于T2DM的治疗药物除了二甲双胍之外的靶点主要集中在钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂（SGLT2）、胰高糖素样肽受体激动剂（GLP-1RA）、或二肽基肽酶4抑制剂（DPP-4i），药物存在的副作用包括低血糖、胃肠不耐受（呕吐、腹泻）、 维生素B12的缺乏、急性肾损伤等等（American Diabetes, A., 2020）。因此开发更为安全有效的靶向GK的降血糖活性成分对于解除民生痛点、提高国民的健康保障和生活质量具有至关重要的意义。

本课题组获得的独立知识产权的灵芝多糖F31

1 灵芝降血糖活性单峰多糖F31的一级结构表征

本课题组从灵芝Ganoderma. lucidum子实体粗多糖中，经过阴离子交换色谱DEAE Sepharose Fast Flow chromatography和分子筛Sephacryl S300分离纯化，获得灵芝降血糖活性单峰多糖F31.其为一种分子量为15.9 KD的β-构型糖苷键相连的吡喃环杂多糖（专利号ZL. 201210056087.5）。通过分子量和单糖组成测定，糖醛酸还原，酸水解，GC-MS和NMR分析，推断F31的化学结构重复单位如图1。多糖F31的结构不同于现有报道多糖结构，为新化合物。

图1 F31多糖的假设化学结构重复单位

2 灵芝降血糖活性单峰多糖F31的药理药效

灵芝多糖F31可以通过抑制肝脏糖异生途径，改善胰岛素和降低小鼠的脂体比三个方面而改善T2DM小鼠的血糖稳态失衡（Xiao, C., et al., 2012. 2017）。

基于iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）和RNA-seq技术，发现灵芝多糖（F31）可以使GK的mRNA表达和蛋白表达同步升高（图2），对于F31调节血糖稳态至关重要（Xiao, C., et al., 2018）。因此，灵芝单峰多糖F31可靶向调节肝脏GK的表达而降低T2DM小鼠的血糖。

图 2 基于iTRAQ和RNA-seq探究灵芝多糖F31降血糖的假设机制图

（转录组数据用蓝色, 蛋白质组数据用红色, 红色箭头表示上调, 蓝色表示下调）

3 灵芝多糖F31的非临床药代动力学研究

灵芝多糖F31经异硫氰酸荧光素FITC标记为F31-FITC，再经SD大鼠灌胃后，收集不同时间的大鼠眼眶血，组织，尿液和粪便，利用荧光（Ex=488nm, Em=520nm）检测F31-FITC在体内的血药浓度-时间曲线图，在不同器官组织的分布和排泄规律。

通过对比分析给药前后动物血清样品的荧光液相图谱发现，F31-FITC能够被吸收进入到血液，且在给药后4h左右血液浓度达到最高点，半衰期t1/2为9h左右（图3）。单次给药后，F31-FITC首先经肠道吸收进入血液，再逐渐分布于体内各个组织器官，给药24小时后肝脏中的药物含量最高；通过对动物排泄物72h的检测发现，单次给药后绝大部分F31-FITC（85.15%）是通过粪便（84.14%）及尿液（1.01%）排出体外，且12h内通过粪便的排泄量就超过了一半以上（48.82%）。

图 3 不同剂量的F31-FITC大鼠灌胃后平均药时曲线图

参考文献：

American Diabetes, A. 9. Pharmacologic Approaches to Glycemic Treatment: Standards of Medical Care in Diabetes-2020. Diabetes Care, 2020. 43: S98-S110.

A, P. S., A, I. P., A, P. S., et al., Global and regional diabetes prevalence estimates for 2019 and projections for 2030 and 2045: Results from the International Diabetes Federation Diabetes Atlas, 9(th) edition. Diabetes Res Clin Pract, 2019. 157: 107843.

Cho N. H., Shaw J. E., Karuranga S., et al., IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2017 and 2045. Diabetes Res Clin Pract, 2018. 138: 271-281.

Lei, L., Liu, S. N., Li, Y. Q., et al., The potential role of glucokinase activator SHP289-04 in anti-diabetes and hepatic protection. Eur J Pharmacol, 2018. 826:17-23.

Matschinsky, F. M., & Wilson, D. F. The Central Role of Glucokinase in Glucose Homeostasis: A Perspective 50 Years After Demonstrating the Presence of the Enzyme in Islets of Langerhans. Front Physiol, 2019. 10.

Petersen, M.C., Vatner, D.F., Shulman, G.I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol, 2017. 13: 572-587.

Xiao, C., Wu, Q.P., Cai, W., et al., Hypoglycemic effects of Ganoderma lucidum polysaccharides in type 2 diabetic mice. Arch Pharm Res, 2012. 35:1793-1801.

Xiao, C., Wu, Q., Xie, Y., et al., Hypoglycemic mechanisms of Ganoderma lucidum polysaccharides F31 in db/db mice via RNA-seq and iTRAQ. Food Funct, 2018. 9: 6495-6507.

Xiao, C., Wu, Q., Zhang, J., et al., Antidiabetic activity of Ganoderma lucidum polysaccharides F31 down-regulated hepatic glucose regulatory enzymes in diabetic mice. J Ethnopharmacol, 2017. 196: 47-57.