JACS封面 | 利用生物纳米孔首次解析复杂聚糖结构

学术前沿

近期，中国科学院上海药物研究所团队在前期的工作基础上，设计并构建了一种工程化生物纳米孔，该纳米孔首次实现了对复杂聚糖的直接鉴定，该工作是生物纳米孔糖测序技术研发进程中又一节点性工作。相关内容于2024年4月11日以“Direct Identification of Complex Glycans via a Highly Sensitive Engineered Nanopore”为题在线发表在Journal of the American Chemical Society(SCI一区TOP，IF=15.0)上，并被选为封面文章。

文章内容

生命体的三类生物大分子包括糖和蛋白质、核酸，其中糖是自然界中的最大的生物能量库,也是自然界中最大的生物信息库，在多种生物过程中发挥重要作用。天然多糖具有多种生物学活性，如免疫调节、降血糖、抗肿瘤、抗氧化等。不像核酸和蛋白质等其他生物大分子，多糖复杂的化学性质使得其结构解析一直具有较大难度，而多糖的结构对于其发挥药效活性以及研究构效关系是至关重要的。

实现高效的糖结构解析是其活性与功能研究的基础，是推动糖科学发展的必要历程。因此，迫切需要开发创新的糖测序技术。纳米孔作为一种新兴传感技术，可在单分子水平上高灵敏度、高时空分辨率地提供分析物的完整结构信息，在分子结构解析中表现出便携、低成本、高灵敏度、高分辨率等优越性。在过去的几十年里，纳米孔技术在生物大分子核酸与蛋白质序列解析或结构鉴定方面取得了革命性突破，这为糖的测序带来了希望，可能发展成为新一代糖测序技术。

一些研究初步证实了生物纳米孔如α-溶血素(α-HL)、耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)、和气溶素(AeL)等纳米孔可区分极其微小的糖分子结构差异，如官能团模式，单糖种类，二糖异构体，有无分支等。近期，中国科学院上海药物研究所团队在前期的工作基础上，设计并构建了一种新型的工程化生物纳米孔，首次实现了对复杂聚糖的直接鉴定，该工作是生物纳米孔糖测序技术研发进程中又一节点。

该团队发现α-HL (M113R) 纳米孔在复杂大尺寸糖分子传感时发生不可逆长时程堵塞的情况，对其进行基因工程改造以扩大纳米孔检测范围和信号窗口。该团队最终筛选获得了一种工程化纳米孔α-HL(M113R/T115A)，该纳米孔在检测不同聚合度和不同乙酰氨基数目的多结构差异聚糖时可产生特征性信号(命名为Level 2 events， 图1)。因此，团队成员推测该双突变纳米孔对复杂聚糖的多种结构差异具备综合传感潜力。

图1 M113R/T115A纳米孔糖传感产生特征性Level 2事件

研究团队利用M113R/T115A实现了从五糖到十糖的连续检测，对其实现了显著区分，首次将纳米孔对于糖的读长达到十糖；最后，该纳米孔可同时区分多种糖类结构差异（图2）。进一步通过分子动力学模拟剖析了纳米孔-糖互作模式，阐明了纳米孔高灵敏度鉴定复杂聚糖微小差异的分子机制。

图2 纳米孔直接鉴定复杂聚糖的多种结构差异

同时，团队成员提出了生物纳米孔直接鉴定复杂聚糖混合物的技术路线。通过多参数电信号指纹图谱映射的方法，M113R/T115A纳米孔可直接快速地从混合物中鉴定不同链长水平的糖分子异构体，区分度达0.9（图3）。

图3 不同链长糖分子异构体的快速鉴定

聚糖的结构差异包括了各种单糖组成、多种形式的糖苷键、长短不一的链长和分支等，这给聚糖分析带来了巨大的挑战。近年来，研究人员在开发基于纳米孔的聚糖鉴定方法方面做出了重大努力。这些工作为最终实现纳米孔糖测序目标提供了宝贵的见解。但迄今为止，该领域仍处于初步阶段，仍需要进一步研究。该团队提供了一种实现复杂聚糖结构解析的纳米孔设计范式，研究设计的全能型工程化纳米孔可基于无标签但高分辨率的方法实现对聚糖结构的全方位识别，其单糖分辨率，链长读取能力，异构差异识别攻克了纳米孔糖测序发展过程中一些不可避免的难点，是实现纳米孔糖测序的重要基石。

文章信息

      中国科学院上海药物所/上海科技大学/临港实验室联合培养博士生姚广大，上海药物所田银平博士，上海药物所博士生柯文军，上海药物所副研究员夏冰清为本文第一作者；上海药物所/南京中医药大学联合培养博士生方洁，上海药物所博士后马圣洲，上海药物所研究员李铁海为本文共同作者；上海药物所高召兵研究员、文留青研究员、夏冰清副研究员和程曦研究员为本文共同通讯作者。本研究工作得到了南京大学龙亿涛教授和应佚伦教授的支持和帮助。本研究获国家杰出青年基金、青促会创新基金、上海市糖专项、上海市科技创新行动计划基金、上海市启明星计划、上海市自然科学基金、国家重点实验室计划等项目的支持。

全文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c02081