瓦尼桑黄多糖硒纳米颗粒复合物的制备、表征及抗肿瘤活性研究

本篇文章是上海市农业科学院食用菌研究所、杭州市农业科学院、上海生物制品研究所有限公司三家共同实验撰写，于2024.07.14发表在Carbohydrate Polymers 期刊上，其IF=10.7 。

瓦尼桑黄（Sanghuangporus vaninii）是一种有含多糖、黄酮类化合物、多酚等多种活性物质的药用真菌，有研究表明，瓦尼桑黄多糖可以通过改变肠道微生物群、干扰葡萄糖代谢、诱导自噬和凋亡以及刺激免疫反应，从而抑制肿瘤生长。此研究是从被高粱酒浸泡后的瓦尼桑黄中提取多糖，并将其进一步用作与硒纳米颗粒（SeNPs）复合的稳定剂，同时对其结构性质和稳定性进行了研究，还探讨了瓦尼桑黄多糖（SVL-3）修饰的SeNPs对癌细胞生长的协同抑制作用。

多糖（SVL-3）分离、纯化、单糖成分分析和分子量测定

在本研究中，首先从瓦尼桑黄的残留物中提取并纯化了一种异聚糖（SVL-3），其平均分子量为2.428×104 Da，由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、果糖和3-O-甲基半乳糖组成（图1C）、（图2）。通过进一步的分析，确定了SVL-3的主链和支链结构，这为后续的SeNPs功能化提供了重要的结构信息。在多糖制备中，首先将在高粱酒（52标准酒精度）中浸泡三个月的瓦尼桑黄子实体干燥、粉碎并过筛（孔径为0.15 mm）。固体样品（1 kg）用蒸馏水（20 L）提取，然后在水中煮沸2 h，在8000 r/ min（10 min）下离心，得到上清液。重复该过程两次。收集上清液后，浓缩至1 L，加入95%乙醇至最终乙醇浓度为20%。将样品混匀，4 ℃静置8 h，离心（8000 r/min，10 min），收集上清液。此后，向上清液中加入95%乙醇，直至乙醇浓缩至50%，混合均匀后4 ℃放置8 h，离心（8000 r/min，10 min），得到沉淀。再次用50%乙醇洗涤沉淀。最后，冷冻干燥后得到桑黄粗多糖（SVL）。为了进一步分离，将一部分SVL溶解于蒸馏水中，然后施加到SephacrylTMS-300高分辨率凝胶上，用过滤的（0.22 μm膜）蒸馏水以2 mL/min的速率洗脱。根据振荡检测器的结果，收集了多糖洗脱峰（图1A）。最后，进一步获得一个对称单峰样品（SVL-3）并冻干用于后续研究（图1B）。

在多糖的分子量和单糖组成分析中，SVL-3的多糖含量通过苯酚硫酸法测定。SVL-3的分子量（Mw）通过高效体积排阻色谱法（HPSEC）测定。使用高效阴离子交换色谱系统（HPAEC，ICS 2500，Dionex，NMR）分析SVL-3的单糖组成(图1D)。

图1（A） SVL-3的洗脱峰曲线。；（B） SVL-3的高效凝胶渗透色谱图（单峰）；（C） SVL-3的单糖组成的NMR图；（D） SVL-3的红外光谱图的。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

图2 通过NMR仪器进行分析得到单糖组成分析。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

多糖（SVL-3-SeNPs）制备、特性分析、稳定性实验

多糖SVL-3修饰的硒纳米颗粒（SVL-3-SeNPs）是通过氧化还原法制备的(图3A)，将不同浓度的SVL-3多糖溶液与10 mM Na 2SeO 3溶液（多糖与Se的比例为2：1、5：1、10：1、20：1）混合，在25 ℃下磁力搅拌30 min，然后逐滴加入与Na2SeO3溶液等体积的抗坏血酸（40 mM），在25 ℃下避光反应4 h。另外，用去离子水代替SVL-3的多糖溶液作为对照。最后，将产物在蒸馏水中透析（3500 Da）48-72小时。

成品SVL-3-SeNPs的表征：SVL-3-SeNPs的多糖含量通过苯酚硫酸法测定，SVL-3-SeNP的粒度(图3C)、电势(图3D)和多分散性指数（PDI）(图3E)通过NanoBrook 90 Plus帕尔斯纳米颗粒粒度电势计（Zhou等人，2022年）的报告。借助场发射透射电子显微镜（TEM-EDS）观察了样品的形貌，并对样品进行了表征分析Se、C和O的含量。在200-800 nm范围内，使用紫外-可见分光光度计测定紫外吸收光谱。通过红外光谱仪收集红外光谱。此外，利用粉末衍射仪，使用X射线衍射（XRD）分析评估样品的物理特性。

稳定性实验是将SVL-3-SeNP分散在去离子水中，通过改变储存天数（0、7、14、21和28天）、储存温度（4 ℃和25 ℃）和pH（2、4、6、8、10和12）来观察其稳定性(图3B)，以检测SVL-3-SeNP的粒度、电位和PDI。

结果表明，以质量比SVL-3/Se = 5:1制备的SVP-3-SeNP具有颜色、粒径、电位和PDI的最佳表征。

图3（A） 通过氧化还原法制备SVL-3-SeNPs；（B） 0天和28天的可视化稳定性分析；（C） SVL-3-SeNPs的粒径。；（D） SVL-3-SeNPs的电位；（E） SVL-3-SeNPs的多分散性指数。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

图4 (A) SVL-3的体积排阻色谱（SEC）图；(B) SVL-3的离子色谱（IC）图 ；(C) SVL-3的核磁共振（NMR）谱图 ；(D) SVL-3的红外光谱（IR）；(E) 透射电子显微镜和能量色散X射线谱下(TEM-EDS)的Se；(F) 透射电子显微镜和能量色散X射线谱下(TEM-EDS)的C；(G) 透射电子显微镜和能量色散X射线谱下(TEM-EDS)的O；(H) SVL-3- SeNPs的合并视图；(I)  SVL-3和SVL-3-SeNPs（硒纳米颗粒）的X射线衍射（XRD）光谱 ；(J)  SVL-3和SVL-3-SeNPs的紫外-可见（UV-vis）吸收光谱  ；(K) SVL-3和SVL-3-SeNPs的红外光谱（IR）。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

SVL-3-SeNPs对抑制MCF-7细胞的影响

在细胞水平上，研究了SVL-3-SeNPs对乳腺癌细胞MCF-7的抑制效果。实验结果表明，SVL-3-SeNPs能显著抑制MCF-7细胞的增殖（图5 A）。

在实验过程中SVL-3-SeNPs可以剂量依赖性地抑制MCF-7细胞增殖。与对照组相比，SVL-3-SeNPs处理的细胞以凝固或球状形式出现橙红色荧光，并随着SVL-3-SeNPs浓度的增加而增加，这进一步证实了SVL-3-SeNPs刺激可以抑制MCF-7细胞的增殖并诱导细胞凋亡(图5 B)。

图5（A）SVL-3-SeNPs对MCF-7细胞的抑制作用 ；（B）AO/EB染色，加入SVL-3-SeNPs后MCF-7细胞的状态。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

实验结果表明，与对照组相比，在SVL-3-SeNPs治疗48小时后，G0/G1和G2/M阶段的细胞比例下降。同样，SVL-3-SeNPs治疗72小时后，G2/M期的细胞比例显著降低，S期细胞比例显著增加(图6A、图6B、图6C)。表明，SVL-3-SeNPs可以通过阻断MCF-7细胞的S相来抑制细胞增殖。

图6 SVL-3-SeNPs对MCF-7细胞周期阻滞的影响，测定细胞周期分布。（A）在SVL-3-SeNPs处理48小时和72小时；（B）处理48小时（C）处理72小时。(图片来源文献doi: 10.1016/j.carbpol.2024.122468.)

总结

本研究成功从瓦尼桑黄中提取并纯化了一种异聚糖（SVL-3），并将其用作硒纳米颗粒（SeNPs）的稳定剂，制备了瓦尼桑黄多糖硒纳米颗粒复合物（SVL-3-SeNPs）。实验结果表明，SVL-3-SeNPs具有显著的抗肿瘤活性，能够抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，并诱导细胞凋亡。通过细胞周期分析发现，SVL-3-SeNPs能够阻断MCF-7细胞的S区间，从而抑制细胞增殖。此外，该研究还深入探讨了SVL-3-SeNPs的结构性质、稳定性，并对其表征进行了详细分析。研究结果不仅提供了一种提高硒纳米粒子稳定性和生物活性的新方法，而且为开发新型的靶向抗癌药物提供了潜在的材料。

参考文献：Chu W, Liu P, Zhang Z,et,al. Preparation, characterization and cytotoxic activity of selenium nanoparticles stabilized with a heteropolysaccharide isolated from Sanghuangporus vaninii residue. Carbohydr Polym. 2024;343:122468.