稀有人参皂苷compound K（Ginsenoside compound K，CK）是哺乳类动物在服用人参或者天然人参皂苷后，通过肠道的降解作用，在血液中检测到的有效物质；其在天然人参属植物中并不存在，具有生理活性：①对多种癌症起到促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞转移和抑制肿瘤生长等作用；②具有恢复受损的学习和记忆、神经保护作用，并且在神经传递调节中发挥重要作用；③具有抗炎症作用，能够抑制炎症因子的释放和调节炎症相关代谢通路；④具有抗过敏作用；⑤具有保肝作用，能够提高肝细胞损伤模型中肝细胞的存活率；⑥具有抗关节炎作用；⑦具有抗糖尿病、抗血管形成以及一定的抗衰老作用。

紫芝（Ganoderma sinense）又称黑芝、玄芝、木芝、中国灵芝，是中国特有的珍稀食药用真菌品种之一。富含多糖、灵芝酸等三萜类物质成分，具有抗衰老、提高机体免疫功能、保肝护肝、抑制肿瘤等功效。由于其本身含有多糖以及三萜类化合物，其能够产生较多种类的糖苷酶，故可转化天然皂苷为稀有人参皂苷CK。

来自浙江大学的研究团队以紫芝为发酵菌，进行发酵培养，利用天然皂苷（绞股蓝总皂苷、三七总皂苷、人参总皂苷中的一种）生物转化合成稀有人参皂苷CK。

方法一：

（1）菌种活化，将配置好的活化培养基进行高温高压灭菌，冷却并倒好平板，将冷冻保存的紫芝CGMCC 5.69菌株接种至活化培养基上，在25℃培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。

▲利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法流程图

（2）种子培养：取500mL的锥形瓶，每瓶装入100mL的种子培养基，高温高压灭菌冷却，挖取1.5cm×1.5cm的活化后的菌块，接种到装有100mL种子培养基的锥形瓶中，在25℃的条件下，摇床培养5d。

（3）发酵培养：在气升罐中加入发酵培养基，高温高压灭菌，取上述种子液接种到发酵培养基内，25℃发酵培养6d，加入天然皂苷后，转化发酵6d。其中，天然皂苷采用绞股蓝总皂苷，添加前，先将绞股蓝总皂苷溶解于500mL乙醇，无菌滤膜过滤除菌，以蠕动泵添加入气升罐，添加量为1mg/ mL发酵培养基。

（4）萃取分离：发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正丁醇，对发酵液进行萃取2～3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂苷CK粗产品；再以适量色谱纯甲醇溶解，使用HPLC测定CK浓度，产量为1.478mg/L。

▲方法一发酵培养基中天然皂苷添加情况、CK产量及转化率

方法二：

（1）菌种活化：将配置好的活化培养基高温高压灭菌冷却，并倒好平板，将紫芝CGMCC 5.69菌株接种至灭菌后的活化培养基平板上，在25℃培养箱中，培养7d，至平板布满菌丝为止，平板备用。

（2）发酵培养：取锥形瓶，装入发酵培养基，高温高压灭菌冷却，挖取1cm×1cm的活化后的菌块，接种到装有种子培养基的锥形瓶中，在25℃的条件下，摇床培养4d、5d、6d、7d，后加入天然皂苷至0.5mg/ mL、1.0mg/ mL、1.5mg/ mL、2.0mg/ mL，再转化发酵至总时长为12d。其中的天然皂苷采用绞股蓝总皂苷，添加前，将绞股蓝总皂苷溶解于5mL 50％乙醇水溶液，无菌滤膜过滤后添加入培养基，添加量为0.5mg/ mL、1mg/ mL、1.5mg/ mL、2mg/ mL发酵培养基。

（3）萃取分离测定：发酵培养后，取与发酵液等体积的水饱和正丁醇，对发酵液进行萃取2～3次，合并有机相，减压旋蒸，得到稀有人参皂苷CK粗产品；再以适量色谱纯甲醇溶解，使用HPLC测定CK浓度。

▲方法二发酵培养基中天然皂苷添加情况、CK产量及转化率

结果可以看出，绞股蓝总皂苷添加量为1.5mg/mL发酵培养基，在发酵温度为25℃、摇床转速为180rpm的条件下，发酵6天后加入皂苷的平均转化率最高，最平均转化率为6.448mg/L；当绞股蓝总皂苷添加量为2mg/mL发酵培养基，发酵6天后加入皂苷的稀有人参皂苷CK产量最高，平均产量为11.415mg/L。

综上所述：本发明提供了一种利用天然皂苷进行生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法，该方法不仅能够转化得到生物活性较高的人参皂苷，而且利用食药同源真菌紫芝进行转化，保证了产物的安全性，发酵产物中的多种生物活性物质能增强发酵产物的保健功能，提高了人参皂苷的市场价值。

* 技术内容来源：《一种利用天然皂苷生物转化合成稀有人参皂苷CK的方法》陈启和、吴嘉南、牛永武、胡竞进