Cell Reports | 云芝和弯孢胶化孔菌中4-羟基苯甲酸代谢途径完整解析

序 

本研究是2021年PNAS的文章“云芝和弯孢胶化孔菌对木质素代谢物的胞内降解”的延续性工作，在上一篇文章中作者证明了云芝等真菌能够利用木质素降解产物对羟基苯甲酸和香草酸作为唯一碳源进行生长，并初步筛选并鉴定了部分催化对羟基苯甲酸转化的基因。在本文中，作者详细的研究了对羟基苯甲酸降解的hydroxyquinol途径中的每一个酶的催化过程。其中利用蛋白结构来挖掘酶的方法非常有趣。本研究还对研究的酶进行了结晶和蛋白晶体结构解析，通过结构更好的揭示了蛋白的催化机理，但是蛋白晶体部分本文并未介绍，有兴趣的可以看原文。

发表期刊：Cell Reports

通讯作者：Davinia Salvachúa

DOI号：10.1016/j.celrep.2024.115002

摘要

白腐真菌是自然界中降解木质素效率最高的生物，但是直到最近才有研究证明白腐真菌可以利用木质素单体芳香族化合物作为碳源进行生长。之前的研究表明真菌中该类化合物主要通过苯三酚（hydroxyquinol）途径来进行转化，但目前真菌中该途径的基因及其功能仍不清楚。本研究从两种白腐真菌（云芝和弯孢胶化孔菌）中克隆鉴定了了7个酶，这些酶催化了从4-羟基苯甲酸盐到β-酮己二酸的四步酶促级联反应。作者还对其中4个酶的蛋白结构进行了解析。本研究扩展了人们对于白腐真菌芳香族化合物代谢途径的理解，展示了从木质素降解产物到高值化合物β-酮己二酸的转化策略，推动了木质素高值化的研究。

真菌中4HBA降解途径分析

• GsMNX1能够催化对羟基苯甲酸、原儿茶酸和香草酸的氧化脱羧反应

图1  白腐真菌中推测的酶催化hydroxyquinol途径

hydroxyquinol途径第一步反应是由MNX1催化的氧化脱羧反应，将4-羟基苯甲酸转化为对苯二酚。通过生物信息学分析在两种白腐真菌中鉴定到了多个MNX1的同源蛋白，其中三个蛋白(TRAVEDRAFT_32834,CERSUDRAFT_120062,和CERSUDRAFT_90429)能够在大肠杆菌中表达出可溶性蛋白。HPLC验证表明CERSUDRAFT_120062（重命名为GsMNX1）能够利用NAD[P]H催化对羟基苯甲酸（4HBA）和原儿茶酸的脱羧反应（图1A）。

底物特异性实验证明，GsMNX1可以分别催化4HBA、原儿茶酸和香草酸转化为hydroquinone、hydroxyquinol和2-methoxyhydroquinone（图1A、B），不能催化2-羟基苯甲酸、3-羟基苯甲酸和丁香酸的脱羧反应。作者利用氧电极法比较了过氧化氢酶存在的情况下的氧气消耗速率，研究了GsMNX1反应解偶联（无效循环）的程度（在完全反应解偶联的情况下，会使总氧气消耗量有效降低至一半）。实验未观察到GsMNX1催化4HBA、原儿茶酸或香草酸反应的速率变化，这表明这些反应具有高效的偶联性。米式动力学参数表明GsMNX1催化效率排序为原儿茶酸>4HBA>香草酸。

• MNX3能够催化对苯二酚和间苯二酚的羟基化反应

在苯三酚途径中，第二步反应是对苯二酚的临位（ortho position）羟基化，生成苯三酚。之前的研究中鉴定了来自于云芝的TRAVEDRAFT_58730和来自于弯孢胶化孔菌的CERSUDRAFT_82057催化了该步反应，分别命名为TvMNX3和GsMNX3。本研究利用HPLC验证了TvMNX3和GsMNX3可以将对苯二酚转化为对苯三酚，同样的条件这两个酶不能转化4HBA和原儿茶酸。

为了检测TvMNX3和GsMNX3的底物特异性，确定羟基化反应作用位置，作者检测了两种酶催化苯酚，邻苯二酚，间苯二酚的活性（图1B）。所有的底物都能够造成氧气的消耗。然而，在邻苯二酚和苯酚存在的条件下，加入过氧化氢酶后，TvMNX3和GsMNX3催化反应的速率减半。这表明发生了完全的反应解偶联。以对苯二酚和间苯二酚作为底物的时候，加入过氧化氢酶并没有导致氧气消耗速率变化，这说明了催化以上两种底物不存在解偶联现象。

TvMNX3和GsMNX3对 对苯二酚和间苯二酚的催化符合米式动力学特征，其稳态动力学参数见表1。以对苯二酚和间苯二酚作为底物时，TvMNX3和GsMNX3的催化效率相当。根据报道有的MNX3在对苯二酚和间苯二酚作用下会出现底物抑制现象，本研究所测试的底物浓度范围（<75 mM）下TvMNX3和GsMNX3未出现底物抑制现象。这表明了这些酶在其他芳香族化合物存在的情况下适应性更强。

表1 酶催化动力学参数

• MNX1催化的氧化脱羧反应先于MNX3催化的羟基化反应

为了确认MNX1和MNX3催化反应的先后顺序，并鉴定不同底物的反应抑制效应，本研究检测了4HBA、原儿茶酸、香草酸、2-甲氧基对苯二酚对TvMNX3和GsMNX3催化对苯二酚羟基化反应的影响。4HBA、原儿茶酸、香草酸存在的时候，MNX3催化反应的初始速率降低到原来的一半，2-甲氧基对苯二酚对于反应没有影响。4HBA对MNX3的抑制效果最为显著，由Lineweaver–Burk双倒数图中的平行拟合线可以证实，4HBA表现为一种中度的非竞争性抑制剂。相反，对苯二酚对GsMNX1催化的4HBA的脱羧反应没有影响。结合酶的底物特异性（表1），以及底物反馈抑制试验，作者认为MNX1催化的4HBA氧化脱羧反应发生在MNX3催化反应之前。

• 双加氧酶催化苯三酚开环反应

图5 4HBA到β-酮己二酸的酶促转化

白腐真菌中对苯三酚代谢途径的下一步反应是由双加氧酶催化的苯三酚的邻二醇型（intradiol）开环反应。本研究中对来自于云芝的TRAVEDRAFT_28066（TvHDX1）和来自于弯孢胶化孔菌的CERSUDRAFT_116134（GsHDX1）进行了研究（图1A）。因为反应底物苯三酚不稳定，产物无商业化试剂，因此酶活测定采用的是链式反应，加入了一个还原酶MAR1。该酶可以将马来酰乙酸盐催化生成β-酮己二酸，而后者可以用HPLC检测（图1A）。反应结果表明，TvHDX1、GsHDX1能够以等摩尔量的方式将苯三酚转化为马来酰乙酸盐。底物特异性显示TvHDX1、GsHDX1也可以催化邻苯二酚的开环反应，但是在苯三酚作为底物的时候催化活性更高。催化反应符合米式动力学参数，TvHDX1、GsHDX1对于苯三酚的催化效率处于同一水平。

• 马来酰乙酸盐还原为β-酮己二酸

对苯三酚途径中最后一步反应是将马来酰乙酸盐还原为β-酮己二酸，这一代谢途径在真菌中尚未研究清楚。由于两个真菌基因组中缺少跟细菌催化该步骤的蛋白同源的蛋白序列，因此无法通过序列比对进行筛选。本研究采用了蛋白结构模型预测（AlphaFold或者SwissModel）来鉴定该还原酶。从而筛选出了云芝中的TRAVEDRAFT_113954和来自于弯孢胶化孔菌中的CERSUDRAFT_114286催化了该步反应，两个酶分别命名为TvMAR1和GsMAR1。研究发现MAR1可以使用NAD(P)H作为电子供体，将马来酰乙酸盐还原为β-酮己二酸（图5），TvMAR1的催化效率略高于GsMAR1。

• 从4HBA到β-酮己二酸的体外酶促级联反应

为了验证白腐真菌中完整的hydroxyquinol途径，同时确认真菌MAR1的产物，本研究在胞外测试了来自于弯孢胶化孔菌的全部酶的级联反应。在反应中，在4HBA中加入了1 μM的GsMNX1、GsMNX3、GsHDX1和GsMAR1酶，对底物的消耗和β-酮己二酸的含量进行了定量检测，同时检测了中间代谢产物的含量。经过16h的反应，几乎所有的底物都转化成为了β-酮己二酸。并没有检测到对苯二酚或者苯三酚的积累。总体来说，以上的结果证明了弯孢胶化孔菌中有4HBA到β-酮己二酸的完整代谢途径（图1）。

讨论

本文完整揭示了白腐真菌中4HBA降解的hydroxyquinol途径的全部酶促反应过程。从每一步酶的催化效率可以看出来催化效率逐渐升高，在对苯三酚开环裂解这一步达到最高（图5）。推测主要目的是为了防止不稳定、有毒的对苯三酚的积累。

GsMNX1除了能够催化4HBA的反应还可以催化其他芳香族化合物中间代谢产物（如原儿茶酸）和其他木质素相关化合物（如香草酸）的脱羧反应，这表明了白腐真菌中存在未被阐明的相互关联的分解代谢途径。从整个代谢系统来看，加氧酶在某些木质素相关芳香族化合物上表现出的反应解耦联（无效循环）现象。这些加氧酶的反应解耦联可以生成过氧化氢为参与木质素降解的一些胞外酶提供氧化剂。有一点无法解释的是，为什么白腐真菌需要进化出来hydroxyquinol途径，而不是和细菌一样采用传统的以原儿茶酸和邻苯二酚作为开环底物。这一点今后需要利用基因敲除等手段在体内进行验证。

虽然本研究主要聚焦具有对香豆醇型环取代模式（即芳香环上不含甲氧基）的化合物，但未来的工作将旨在揭示木质素降解型白腐真菌中G型和S型单体转化的新途径。

整体来说，本研究对更全面理解全球碳循环以及自然界中木质素相关化合物在真菌生物质中的碳固存方面做出了贡献。