文献分享｜多组学联合分析：茯苓酸通过调节肠道微生物群改善非酒精性脂肪性肝病

茯苓是一种药食同源中药材，其主要活性成分之一是茯苓酸（Pac），具有抗血脂、降血糖的作用。然而，它对高脂饮食引起的肠肝轴的生化变化的影响仍然知之甚少。本研究采用高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型，探讨Pac的保护作用机制。肠道微生物区系的16S rRNA测序结果表明，Pac能降低肠道菌群比，恢复阿克曼氏菌的丰度，减少硫弧菌和链球菌的数量，改善肠道菌群失调。同时，Pac主要通过调节内毒素/TLR4/MYD88/NFκB通路，减少肝脏炎症因子的表达。肝脏转录组分析表明，Pac主要影响与脂质代谢、细胞凋亡和炎症反应相关的基因。具体地说，Pac抑制FASN、SREBP1c和Scd1的表达，而上调PPARα和CPT1α的表达，从而改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性。此外，Pac处理减少了肝细胞的凋亡。Pac干预后的非靶向肝脏代谢组学分析显示，酰肉碱和油酸水平升高。总而言之，这些发现表明，Pac Alle通过调节肠道微生物区系、脂肪代谢、炎症和细胞凋亡来抑制高脂饮食诱导的肝脏脂肪堆积和损伤。这一综合研究对Pac的潜在潜力提供了有价值的见解，并为开发和利用茯苓应对非酒精性脂肪肝提供了参考。

【研究背景】

NAFLD是一种以肝细胞脂肪变性为主要特征的慢性肝脏疾病，常与肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征相关。近年来，随着生活水平提高和营养摄入过剩，NAFLD全球患病率显著上升，已成为重大公共卫生问题。该疾病谱包括从单纯性脂肪变性（NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），后者表现为炎症和肝细胞气球样变，提示更严重的肝损伤。若不干预，NAFLD可进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。目前尚无针对性批准药物，这一治疗缺口促使广泛研究致力于阐明其分子机制，主要包括脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应和纤维化等病理过程，旨在开发有效治疗策略以改善临床结局。

近年研究凸显肠道菌群与NAFLD之间存在密切关联，主要通过“肠—肝轴”这一双向调节通路实现。肠道菌群参与食物消化、维生素合成、免疫调节和肠道稳态维持，其失衡可导致肠道屏障破坏、内毒素易位，进而触发肝脏炎症与损伤。例如，Akkermansia等有益菌可减轻炎症、调节代谢，而菌群失调与肥胖、糖尿病和心血管疾病密切相关。因此，调控菌群结构和增强肠屏障功能成为缓解NAFLD的重要策略。茯苓作为药食两用的传统中药，其主要活性成分Pac具有降脂、抗炎、抗氧化和改善糖代谢等多重药理活性，显示出在代谢紊乱如NAFLD和肥胖方面的潜在应用价值。本研究旨在探讨PAC减轻肠道微生物区系失调和非酒精性脂肪肝损伤的可能机制。通过对肝脏进行全面的转录组和代谢组学分析，我们的目标是揭示支撑Pac有益效果的分子途径和代谢变化。本研究成果有望为PAC在NAFLD防治中的应用提供坚实的理论基础。

【研究内容】

1. Pac对HFD小鼠IGTT、IITT、肝指数、血清参数、肝脏参数和组织病理学的影响

在高脂饮食（HFD）诱导的非酒精性脂肪肝病（NAFLD）小鼠模型中，Pachymic acid（Pac）表现出显著的改善作用。于第10周和11周分别进行的葡萄糖耐受试验（GTT）和胰岛素耐受试验（ITT）显示，HFD导致小鼠糖耐量和胰岛素敏感性受损，而Pac处理显著缓解了这一现象（p < 0.05，图1a）。胰岛素抵抗可促使肝脏糖异生失控和脂质持续沉积，进而加剧脂肪肝发展。经过12周饲养，Pac还显著抑制了HFD引起的体重增加（p < 0.05，图1C）。解剖可见HFD组肝脏颜色加深、体积增大并伴有明显脂质沉积，Pac则显著降低了肝体比（p < 0.05，图1d）。血清学检测显示，HFD组丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平升高，Pac干预后二者均显著下降（p < 0.05，图1E，F）。同时，Pac还降低了血清和肝脏中的甘油三酯（TG）含量（p < 0.05，图1g，H）。组织病理学结果（H&E和Oil Red O染色）进一步证实，Pac有效减轻了肝细胞脂肪变性、空泡化和脂滴积聚（图1I）。这些结果表明，Pac能够通过调节脂代谢和减轻炎症，发挥肝保护作用，维护肝脏稳态功能。

图1.Pac能有效减轻NAFLD小鼠肝脏脂肪变性和肝损伤。(A&B)小鼠的胰岛素抵抗、糖耐量试验和AUC曲线。(C&D)小鼠肝脏重量、肝体比。(E&F)血浆ALT、AST水平。(G)血浆甘油三酯水平。(H)肝脂甘油三酯水平。(I)用H&E(标尺=100μm)或油红O(标尺=50μm)染色的肝组织的代表性图像。本文中数据显示均为平均值±标准差(n=10)，与ND组相比p值<0.05，*与ND组相比p值<0.01；#与HFD组相比p值<0.05，##与HFD组相比p值<0.01。

2. Pac对肝脏转录组的影响

通过RNA测序分析，我们发现HFD显著改变了肝脏基因表达谱。主成分分析（PCA）显示ND组与HFD组明显分离，表明HFD对肝脏转录组有显著影响（图2A）。差异表达基因（DEGs）分析共鉴定出75个在Pac-H组与HFD组之间显著差异表达的基因（图2B，C）。这些基因主要富集在与炎症、凋亡和脂质代谢相关的通路中。

图2.RNA序列分析用于探讨Pac治疗NAFLD的机制。(A)对不同试验组的样品进行主成分分析。(2)不同试验组的VEINE分析。(C)HFD和Pac-H组中75个DEG的表达谱热图。(D)DGS的GO富集区泡沫图。(E)KEGG浓缩DEGS的气泡图。N=每组4例。

3. 功能注释分析

GO和KEGG富集分析显示，HFD与Pac处理组之间的DEGs显著富集于炎症反应、胰岛素信号、肝细胞凋亡、氧化应激、脂质代谢过程、脂肪酸β-氧化等通路（图2D，E）。这些结果表明，Pac可能通过调控与炎症、脂代谢和氧化应激相关的基因表达，减轻HFD诱导的肝脏脂质积累。

4. Pac改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏异常脂肪蓄积

NAFLD的一个特征是肝脏中脂质的异常积聚。为了分析Pac对脂质代谢的影响，对关键的脂代谢相关蛋白的表达水平进行了量化。Western blot分析显示，HFD组中脂肪酸合成酶（FASN）、固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP1c）和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）的表达显著升高（p<0.05，图3A），而Pac处理有效逆转了这一趋势。相反，HFD降低了肉碱棕榈酰转移酶1α（CPT1α）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的表达，Pac则使其表达回升（p<0.05，图3B）。这些结果表明，Pac可能通过激活PPARα通路和抑制SREBP1c/FASN通路，促进脂肪酸氧化并抑制脂质合成，从而改善肝脏脂肪变性。

图3. PAC可改善HFD诱导的脂质蓄积和细胞凋亡。(A)用免疫印迹法检测FASN、SREBP1c、SCD1蛋白在肝脏中的表达。(2)用免疫印迹法检测肝组织CPT1α、PPARα蛋白的表达。(C)肝组织中bcl2、bax的mRNA表达水平。(D)免疫印迹法检测肝组织中Bcl2、Bax蛋白的表达。(E)肝切片TUNEL免疫荧光染色(放大20倍，比例：50 μm)。

5. Pac改善HFD诱导的小鼠肝细胞凋亡

HFD处理降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，升高了促凋亡蛋白Bax的表达，导致Bcl-2/Bax比值下降（p<0.05，图3C，D）。Pac处理显著逆转了这一趋势。TUNEL染色进一步证实，HFD促进了肝细胞凋亡，而Pac处理显著减少了凋亡细胞数量（图3E）。这些结果表明，Pac通过调节Bcl-2/Bax比值，抑制HFD诱导的肝细胞凋亡，发挥肝保护作用。

6. Pac对小鼠肠道微生物分布的影响

为探究Pac对 NAFLD 小鼠肠道菌群的调节作用，本研究采用 16S rRNA 高通量测序技术对粪便菌群进行分析。结果显示，高脂饮食（HFD）显著改变了菌群组成，具体表现为厚壁菌门（Firmicutes）和脱硫杆菌门（Desulfobacterota）丰度上升，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）丰度下降（图4C）。Pac干预后，这些变化得到逆转，尤其显著提高了疣微菌门（主要包括阿克曼菌属 Akkermansia）和拟杆菌门的相对丰度，同时降低了厚壁菌门与脱硫杆菌门的比例。在属水平上，Pac 显著增加了阿克曼菌（Akkermansia）的丰度，该菌与短链脂肪酸生成和代谢健康正相关；同时降低了脱硫弧菌属（Desulfovibrio）和链球菌属（Streptococcus）的丰度，这两种菌与肝脂肪变性和纤维化有关（图4D，G）。β-多样性分析表明，Pac 部分恢复了因 HFD 而紊乱的菌群结构（图4E）。功能预测分析（PICRUSt2）显示，差异菌群主要参与代谢和遗传信息处理通路。这些结果说明，Pac 可通过调节肠道菌群结构，尤其是增加有益菌、减少有害菌，改善 NAFLD 相关的肠道微生态失衡（图4I）。

图4. PAC干预对粪便微生物群落结构和功能的影响(A)稀疏曲线。(B)等级富裕度曲线。(C)该门的微生物区系组成。(D)该属的微生物区系组成。(E)β-多样性。(F)随机森林分析。(G)LDA评分(LDA&>2.0和P<；0.05)。(H)物种组成热图(I)肠道微生物区系16S rRNA基因的PICRUSt2功能预测。n=4。

7. Pac改善HFD诱导的小鼠肝脏炎症

HFD 可引起肠道菌群紊乱，导致肠道屏障功能受损、通透性增加，从而使脂多糖（LPS）等细菌产物进入肝脏，引发炎症反应。H&E染色显示HFD导致小鼠回肠绒毛稀疏、肠壁变薄、肠道屏障受损（图5A）。Western blot显示HFD降低了紧密连接蛋白（ZO-1, Claudin1）的表达（图5B）。HFD还显著提高了血浆脂多糖（LPS）水平（图5C），而Pac处理逆转了这些变化。Pac还显著降低了肝脏中炎症因子（TNFα, IL-6, IL-1β）和趋化因子（Ccl2, Cxcl2）的mRNA和蛋白表达（p<0.05，图5D，E），并抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活（图5F）。免疫荧光染色显示Pac减少了肝脏中巨噬细胞标记物F4/80的表达（图5G）。这些结果表明，Pac通过修复肠道屏障、减少LPS入肝并抑制炎症通路，减轻HFD诱导的肝脏炎症。

图5. PAC可改善HFD诱导的炎症反应。(A)HE染色的回肠组织的典型图像(比例尺=100μm)。(2)回肠组织中ZO-1、Claudin1蛋白的表达。(C)小鼠血浆内毒素含量(n=10)。(D)用免疫印迹法检测肝组织IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子α蛋白的表达。(E)肝脏肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素1β、CCL2、CxCl2mRNA的表达水平。(F)免疫印迹法检测肝组织中TLR4、MYD88、p-p65蛋白的表达。(G)肝切片F4/80免疫荧光染色(放大20倍，比例：50 μm)。

8. Pac对肝脏代谢组的影响

为进一步探究 Pac 通过肠道菌群调节对肝脏代谢的影响，进行了非靶向代谢组学分析。结果显示，HFD显著改变了肝脏代谢物谱，而Pac处理部分逆转了这一趋势（图6A）。差异代谢物主要富集于坏死性凋亡、铁死亡、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸合成、次级胆汁酸合成等通路（图6C）。Pac处理显著提高了多种代谢物的水平，包括酰基肉碱20:5、2b,3a,7a,12a-四羟基-5b-胆烷酸、酰基肉碱14:1和油酸（图6D，E）。网络通路分析表明，这些代谢物在调节能量代谢和抗氧化过程中发挥协同作用（图6F，G）。

图6. 高脂饲料诱导的小鼠肝脏代谢组学分析。(A)不同试验组样本的偏最小二乘判别分析。(2)不同试验组的VEINE分析。(C)采用KEGG分析方法分析变化的主要途径。(D)代谢物前30种不同分析的热图。(E)Pac组和HFD组小鼠肝脏代谢物差异分析的火山图。(F)肝脏代谢和KEGG网络通路分析。(G)肝脏代谢物的相关分析。n=4。

9. 肠道菌群、肝脏代谢物与生化参数之间的关联分析

Spearman相关性分析显示，有害菌Desulfovibrio和Streptococcus与肝脏指数、转氨酶、氧化应激指标、炎症因子和脂质水平呈正相关，而与有益菌Akkermansia呈负相关（图7）。肝脏代谢物酰基肉碱20:5与Akkermansia正相关，与Desulfovibrio负相关；熊去氧胆酸则与Desulfovibrio正相关，与Akkermansia负相关。这些结果提示，Pac可能通过纠正肠道菌群失调，调节肝脏代谢和炎症状态，从而改善NAFLD。

图7. 斯皮尔曼相关分析将前20个丰富的属与肝脏代谢物和生化参数联系起来

图8. Pac通过调节脂代谢、细胞凋亡、炎症信号通路和肠道微生物区系减轻非酒精性肝损伤的机制图。

【结论】

综上所述，研究结果表明，补充Pac能有效改善小鼠的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。通过该干预措施，可以观察到肠道菌群组成发生有益改变，这种改变有助于恢复肠道稳态并增强肠道屏障的完整性。通过肝脏转录组学分析，进一步揭示了Pac对抗NAFLD潜在分子机制的作用途径。蛋白质检测也证实了这些发现，表明Pac通过调节涉及脂质代谢、炎症和细胞凋亡的途径发挥其保护肝脏的作用。总而言之，这些研究成果奠定了对茯苓如何作为功能食品或治疗剂能够缓解非酒精性脂肪性肝病的基础性理解。这些发现值得进一步研究，以便将这些益处转化为临床应用。

【文章信息】

发表时间：2025年3月

期刊：Food Research International

影响因子：IF=8

最高JCR分区/中科院分区：Q1 / 农林科学大类 1区

题目：Multi-omics joint analysis: Pachymic acid ameliorated non-alcoholic fatty liver disease by regulating gut microbiota

DOI：10.1016/j.foodres.2025.116178