科研 | 湖南农大：灵芝发酵绿茶通过调节代谢增加产热途径发挥抗肥胖作用（国人佳作）
导读
高脂肪饮食会导致肥胖和代谢紊乱。灵芝以其丰富的生物活性化合物和多种药理作用而闻名。灵芝发酵绿茶（TFG）已被证明能显著提高体外降脂活性。使用UPLC-MS/MS和GC-MS/MS，本研究在TFG中鉴定出78种活性降脂化合物，通过网络药理学探索了它们的潜在靶点和途径，并通过体内实验进行了验证。在一项为期4周的试验中，70只小鼠被随机分为7组：ND（正常饮食）、HFD（高脂肪饮食）、PC-HFD（含奥利司他的HFD）、NFT1（含200mg/kg/d非发酵茶的HFD，NFT2（含400mg/kg/d NFT的HFD。与HFD组相比，TFG显著降低了小鼠的体重、肝脂滴和附睾脂肪细胞大小。TFG还增加了降脂细菌的丰度，如乳球菌和Lachnospirales。肝脏转录组学和粪便代谢组学分析表明，TFG降低了甘油三酯（TG）、甘油二酯（DG）、单甘油酯（MG）和游离脂肪酸（FFA）水平，并差异调节了参与产热途径的关键基因（Dpf3、Atp5k、ND3）。RT-PCR证实TFG上调了背侧脂肪中AMPK、UCP1、PGC1α和PPARγ的mRNA表达。总之，TFG通过AMPK-PGC1α途径增强产热，增加降脂细菌的丰度，从而减少小鼠的脂肪积累。这些发现为TFG的抗肥胖机制提供了见解，为开发新的减肥方法或产品提供了科学依据。
亮点：
1.灵芝发酵后绿茶的降脂活性提高；
2.TFG可增加小鼠体内有益的降脂细菌；
3.差异基因和代谢物在产热途径中富集；
4.TFG通过AMPK-PGC1α途径促进产热。
论文ID
原名：Green tea fermented by Ganoderma lucidum presented anti-obesity properties via enhanced thermogenesis in vitro and on C57BL/6J mice
译名：灵芝发酵绿茶在体外和C57BL/6J小鼠体内均表现出增强生热作用的抗肥胖作用
期刊：Food Research International
IF：8.0
发表时间：2025.02
通讯作者：刘仲华&黄建安
通讯作者单位：湖南农业大学
实验设计
实验结果
1. TFG的化学成分和降脂活性
如表2所示，与NFT相比，TFG中的总黄酮、茶多酚、儿茶素、可溶性糖和咖啡因分别降低了87.10%、66.99%、77.06%、41.67%和22.48%。此外，游离氨基酸和茶褐素分别增加了1.56倍和9.21倍。与NFT相比，TFG与胆汁盐（甘氨酸钠和牛磺胆酸钠）的结合能力显著增加，表明TFG具有更强的降脂活性（图1）。
表1 用于实时定量PCR的引物
AMPK，AMP-活化蛋白激酶；UCP1，解偶联蛋白1；PGC1α，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子-1α；PRDM16，人含PR域蛋白16；PPARγ，过氧化物酶体增殖激活受体γ。
表2 TFG的主要化学成分
NFT，非发酵茶；TFG，灵芝发酵绿茶
图1 TFG的体外降脂活性
2. UPLC-MS/MS和GC-MS/MS分析
使用UPLC-MS/MS和气相色谱-质谱平台，我们在TFG和NFT的茶叶样本中共鉴定出2772种代谢物（表S1：综合代谢物列表）。这些代谢物包括氨基酸及其衍生物（12.52%）、黄酮类化合物（11.76%）、酚酸（10.71%）、萜类化合物（9.96%）、杂环化合物（6.1%）、酯类（5.63%）、生物碱（4.87%）以及各种其他代谢物（图2）。
图2 TFG组成的环形图。
3. 活性成分靶点分析
我们使用TCMSP和SWISS ADME平台分析收集的化合物。这些数据库初步鉴定出111种具有潜在生物活性的化合物。其中，14种化合物的OB≥30%，DL≥0.10。此外，64种化合物符合胃肠道吸收和药物相似性标准。为了清楚起见，这些发现总结在表S2（TFG的活性化合物和活性预测）中。因此，TFG中的78种成分被归类为“活性成分”。我们通过TCMSP数据库中的“相关靶点”功能确定了这78种化合物的靶点。我们使用Uniprot数据库（www.Uniprot.org/）将蛋白质名称转换为基因名称，并删除没有相应基因名称的靶点。因此，我们获得了与TFG活性成分相关的基因靶点。在删除重复项后，我们共识别出746个独特靶点。
4. 活性成分与脂质代谢靶点的相互作用分析
从GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库中检索与“高脂血症和脂质代谢”相关的靶点，共有1743个靶点符合筛选标准。这三个数据集被导入R包（版本3.5.1），得到212个共同靶点。生成了TFG脂质代谢的维恩图（图3）。我们确定了脂质代谢相关靶点与TFG活性成分靶点之间的交叉点。这些交叉点被认为是TFG对脂质代谢作用的潜在靶点。
图3 “高脂血症和脂质代谢”（左）与TFG靶点的交叉
5. TFG脂质代谢关键成分和靶点的筛选
TFG脂质代谢的212个靶点已上传至STRING数据库(https://string-db.org/)，专门设置为智人，以获得具有2801条边的蛋白质相互作用网络（图S1）。然后分析靶点的蛋白质相互作用（PPI）。随后将得到的数据导入Cytoscape 3.10.1进行进一步分析和可视化。我们使用“网络分析器”插件，检查PPI网络，并根据其度值筛选关键靶点。
6. 核心作用基因富集分析
我们使用注释、可视化和综合发现数据库（DAVID）对潜在靶点进行了富集分析(https://david.ncifcrf.gov/)。通过基因本体（GO）数据库对47个核心靶点进行了进一步的功能富集分析(http://geneontology.org/)，揭示了593个生物过程（BP）、69个细胞成分（CC）和163个分子功能（MF）。在图4中，BP、CC和MF条目根据其富集度得分（−log10 P）按降序排列。我们使用京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库（www.genomen.jp/）分析信号通路的富集，得到179条富集的信号通路。前20条富集的信号通路如Sankey点通路富集图所示（图S2）。左侧是Sankey图，显示了基因的数量及其在每个途径中的分布。右侧是一个气泡图，气泡大小表示基因数量，颜色表示P值。一个免费的在线平台用于结果可视化(https://www.bioinformatics.com.cn/)。
图4 使用GO数据库研究TFG干预脂质代谢的潜在靶点。
如图4和S2所示，鉴定的主要生物过程包括RNA聚合酶II对转录的正向调节、基因表达的正向调节，磷酸化、DNA模板化转录的正向调控、蛋白质磷酸化、细胞群体增殖的正向调控，G蛋白偶联受体信号通路和脂质代谢过程。主要的细胞成分是细胞质、质膜、细胞核和细胞内膜结合的细胞器。主要分子功能包括蛋白质结合、金属离子结合、ATP结合、酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、激酶活性和信号受体结合。糖尿病并发症、非酒精性脂肪肝中涉及的关键途径包括脂质和动脉粥样硬化、代谢途径、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、AGE-RAGE信号通路。
7. 活性成分靶点-通路图分析
根据KEGG通路富集分析结果，我们使用Cytoscape构建了活性成分-靶点-通路的网络图（3.10.1）（图S3）。圆形节点代表关键成分，而平行四边形节点代表关键靶点和信号通路。网络图包含909个节点和2507条边。活性成分的节点颜色越深，活性成分与交叉靶点之间的相关性就越大。对整个网络的分析确定了dihydrodehydrodiconiferyl alcohol、α-亚麻酸、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸异丁酯、lauryldiethanolamine、2（3H）-呋喃酮、二氢-5-（2-辛烯基）-、（Z）-和N-乙酰基-L-色氨酸是关键成分，表明它们可能会显著影响脂质代谢。图S4主要显示了TFG活性成分与其靶基因之间的详细关系。该研究表明，TFG通过多种成分作用于多种靶点，从而影响多种信号通路。
通过DAVID数据库富集分析，TFG的关键靶基因，包括PRKAA2、MAPK14、PRKAB1、MTOR、LIPE、ADRB3、CNR1、PPARG、SLC25A20、PRKACA、HRAS、MGLL和FGFR1，在产热信号通路中显著富集。此外，其他核心靶基因在与产热相关的途径中显著富集，如AMPK信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路和脂肪细胞中脂肪分解的调节。因此，了解TFG和产热之间的潜在联系可以为其在脂肪代谢和肥胖管理中的作用机制提供了有价值的见解。
TFG含有高含量的茶褐素，与其他类型的茶相比，茶褐素是黑茶中观察到的降脂作用的主要生物活性化合物。我们假设茶褐素在介导TFG的降脂作用中起着至关重要的作用。Wang等人发现，茯砖茶中的茶褐素主要激活AMPK-PGC1α通路，促进白色脂肪组织（WAT）的褐变和棕色脂肪组织（BAT）的激活，从而增加能量消耗并减轻小鼠肥胖。AMPK-PGC1α通路在调节脂肪细胞褐变和产热方面起着代谢传感器的作用。此外，AMPK通过PGC1α上调UCP1（解偶联蛋白1）的表达，促进WAT的褐变并激活BAT，从而抑制肥胖。因此，我们在小鼠实验中进一步探索了TFG干预通过产热信号通路对脂质代谢的影响。
8. TFG对小鼠体重、血脂水平和组织学改变的影响
如图5a所示，TFG组小鼠的最终体重和体重增加明显低于HFD组（P<0.05）。TFG组小鼠的最终体重和体重增加与PC组和NFT组没有显著差异。不同组别小鼠的肝脏和附睾脂肪指数没有显著差异。与HFD组和PC-HFD组相比，TFG组小鼠的血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平没有显著差异（图5b）。
图5 TFG对以下指标的影响：（a）体重、肝脏和附睾脂肪指数（n=6），（b）血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C水平（n=6，（C）附睾脂肪组织中单个脂肪细胞的平均面积和肝脂滴的油红O染色面积百分比（n=3），顶部不同字母的条形图表明存在统计学上的显著差异（P<0.05）。
H&E染色显示，与ND组相比，HFD组小鼠的附睾组织切片显示出明显更大的脂肪细胞面积。相比之下，PC-HFD、NFT和TFG组的脂肪细胞面积显著减少。油红O将脂肪染成红色，表明脂肪含量较高，染色面积较大。与HFD组相比，TFG和NFT组肝脏脂滴和附睾脂肪细胞面积显著降低（图5c，S5）。肝脏脂滴大小的减少表明肝脏脂质代谢的潜在改善，而附睾脂肪组织中较小的脂肪细胞可能反映了脂肪减少。
9. 16S rRNA分析揭示，TFG改变了肠道细菌组成
如图6所示，与ND组相比，HFD组减少了拟杆菌属，增加了厚壁菌属，导致厚壁菌门与拟杆菌属（F/B）的比例更高。相反，与HFD组相比，TFG增加了拟杆菌属，减少了厚壁菌属，降低了F/B比值。PC-HFD组表现出最高的F/B比，表明奥利司他比单独使用HFD更有效地减少拟杆菌和增加厚壁菌。
图6 小鼠粪便微生物群门水平相对丰度柱状图。
TFG降低了F/B比，这与之前的研究基本一致。研究表明，HFD增加了小鼠的F/B比值，其特征是厚壁菌门增加，拟杆菌减少，这在肥胖模型中很常见。饮茶通过降低F/B比和促进SCFA的产生对肠道微生物群产生积极影响，这两者都有益于健康。绿茶、乌龙茶和红茶中的儿茶素同样会改变肠道微生物群的组成。此外，生熟普洱茶提取物（PETe）和茯砖茶（FBT）可以逆转HFD诱导的肥胖小鼠F/B比值的增加。
基于粪便微生物群的β多样性主坐标分析（PCoA）显示，各组之间存在重叠（图7），表明微生物群落结构相似。因此，与HFD组相比，TFG、NFT或奥利司他没有显著改变肠道微生物组的组成。
图7 不同群体间β多样性的PCoA分析。
对特定微生物类群的调查揭示了TFG对肠道健康和代谢的微妙影响。在ND、HFD和PC-HFD组中，我们未检测到乳球菌属和乳酸乳球菌，但TFG显著增加了它们的丰度（图8）。与其他组相比，TFG还显著提高了s_Muribaculum_intestinale水平。TFG导致所有组中o_Lachnospirales的粪便丰度最高。
图8 LEfSe分析揭示了不同群体中特定的微生物丰度
Lactococcus chungangensis CAU 28通过减少体重增加和脂质积累来减轻小鼠饮食诱导的肥胖。它抑制TG的形成和FASN和PPARγ等脂肪生成转录因子的增殖，同时通过增加脂联素和降低瘦素来调节血清脂肪因子水平。乳球菌G423通过调节肠道微生物群、显著降低腹部脂肪百分比和血清TG、TC和LDL水平来改善肉鸡的生长和脂质代谢。乳酸乳球菌，如CRL1434，调节HFD诱导的肥胖小鼠的肠道微生物群和代谢参数，降低身体和脂肪组织重量、葡萄糖、胆固醇、TG和炎性细胞因子，同时增加IL-10等抗炎细胞因子。乳酸乳球菌亚种处理西式饮食小鼠可以减少体重增加、肝脏脂肪和炎症，改善葡萄糖耐量。
Muribaculum intestinale是Muribaculaceae科的成员，以降解复合碳水化合物、帮助营养吸收和肠道健康而闻名。毛螺菌科产生类似丁酸盐的SCFA，介导对炎症和胰岛素抵抗的保护作用，增强肠道屏障功能，减轻HFD诱导的胰岛素抵抗。毛螺菌科内的NK4A136组与逆转HFD诱导的生态失调和体重增加有关。这些微生物有助于减少脂肪积累、改善脂质状况、调节脂肪因子水平和增强营养吸收，表明TFG可能部分通过促进这些细菌的增殖来发挥其降脂作用。
10. 利用Tax4Fun预测微生物功能
Tax4Fun通过整合SILVA数据库中的物种注释和KEGG原核分类来预测微生物群落功能。它使用NCBI基因组注释的16S拷贝数对OTU丰度表进行标准化。如图9所示，Tax4Fun用于基于KEGG数据预测产热过程中微生物群落的富集和相关途径。与HFD组相比，TFG组显著增加了PPAR信号通路的相对丰度。
图9 基于KEGG数据库的Tax4Fun分析用于预测微生物功能
11. 通过代谢组学分析，TFG减少了产热途径富集的代谢物
为了阐明TFG通过产热途径降脂作用的机制，我们对粪便样本进行了非靶向代谢组学研究。使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型分析主成分得分，我们发现各组之间存在明显差异（图10a和b），表明与ND和HFD组相比，TFG显著改变了代谢特征。
图10 小鼠粪便代谢组学的OPLS-DA分析：（a）包括ND组；（b） 不包括ND组。
在HFD与ND、TFG1与HFD以及TFG2与HFD组的比较中，我们根据VIP（变量投影重要性）>1和P<0.05确定了差异代谢物。在这些比较中，我们分别在小鼠粪便中检测到4904、4905和4904个差异谱，其中1240、696和584显示出显著的变化。火山图显示了这些不同的代谢物（图11a、b和c）。
图11 小鼠体内不同代谢物的火山图：（a）HFD与ND；（b）TFG1与HFD；（c）TFG2与HFD。
图12显示，在与产热途径相关的差异代谢物中，与HFD组相比，TFG组显著降低了粪便中3种三酰基甘油（TG）、6种二酰基甘油（DG）、1种单酰基甘油（MG）和4种游离脂肪酸（FFA）的水平。先前的研究表明，茶中的生物活性化合物通过抑制消化酶和激活AMPK通路来降低TG、DG和MG水平。Weerawatanakorn等人发现，富含γ-氨基丁酸的乌龙茶通过促进产热、脂质代谢和脂肪酸氧化，同时抑制脂肪生成，显著降低了TG水平。茶多酚抑制脂质和蛋白质的吸收，激活肝脏、肌肉和脂肪组织中的AMPK，减少糖异生和脂肪酸合成，从而降低TG、DG和MG水平。茶中的儿茶素和其他多酚也会抑制消化酶，导致脂质吸收减少，进而降低TG、DG和MG水平。总之，饮茶已被证明可以调节脂肪细胞功能并增加能量消耗，从而通过调节产热相关蛋白和信号通路降低脂质水平。本研究揭示了产热途径中的关键差异代谢物，表明TFG具有显著影响。
图12 TFG对粪便中TG、DG、MG和FFAs水平的影响
茶减少粪便游离脂肪酸与其抗炎特性和增强脂肪酸氧化有关。之前的研究发现，茶化合物可以减少与肥胖和代谢紊乱相关的炎症，改善脂质代谢，降低FFA水平。白茶和乌龙茶上调CPT-1等酶，增强脂肪酸氧化。普洱茶增加了脂肪酸吸收和β-氧化的基因表达，进一步降低了FFA水平。茶多酚激活AMPK途径，促进脂肪酸氧化和抑制脂质生物合成，从而降低FFA水平。
如表3所示，与其他五组相比，添加TFG的组显著降低了粪便乙酸含量（P<0.05）。Tomioka等人也注意到红茶饮用后乙酸浓度的降低。我们推断，TFG改变了肠道微生物群组成，这是SCFA产生的关键因素，导致乙酸水平降低。
表3 TFG对小鼠粪便中短链脂肪酸水平的影响
ND，正常饮食组；HFD，高脂饮食组；PC-HFD，20 mg/kg/天奥利司他组；NFT1，200mg/kg/天NFT组；NFT2，400mg/kg/天NFT组；TFG1，200mg/kg/天TFG组；TFG2，400mg/kg/天TFG组。
12. TFG改变肝脏转录组并调节参与产热途径的基因
为了研究小鼠肝脏转录物的组间差异，我们使用OPLS-DA分析差异表达的基因。组之间的分离越大，表明差异越显著。图13a显示，NFT2、PC-HFD、TFG1和TFG2组与ND和HFD组存在显著差异。HFD和TFG显示出比NFT和PC-HFD更大的差异（图13b）。这表明与HFD和ND组相比，HFD干预组（NFT2、PC-HFD、TFG1、TFG2）的肝脏基因表达存在显著差异（P<0.05）。此外，与HFD和ND组的NFT和奥利司他处理小鼠相比，TFG治疗的小鼠在肝脏基因表达方面表现出更大的差异。这些发现表明，TFG显著调节高脂饮食小鼠的肝脏转录。
图13 小鼠肝脏转录物的OPLS-DA分析结果：（a）包括ND组；（b） 不包括ND组。
图14显示了每个对照组差异表达基因（上调和下调）的分布。在ND组和HFD组之间，684个基因表现出显著的表达变化，其中244个基因上调，440个基因下调，表明高脂肪饮食显著改变了小鼠肝脏中的基因表达。随着茶浓度的增加，NFT和TFG组中差异表达基因的数量显著增加。TFG诱导的肝脏基因表达变化比NFT更大。这些发现表明，TFG更有效地促进了高脂肪饮食小鼠肝脏基因表达的变化。
图14 差异比较组合中差异表达基因的分布
在这项研究中，我们发现TFG差异调节产热途径中的关键基因，如Dpf3、Atp5k和ND3。与HFD组相比，TFG1和TFG2组Dpf3表达降低（P<0.05），而TFG2组Atp5k和ND3表达上调（P<0.05）。其他差异基因也富集产热相关途径，包括MAPK信号通路。TFG1显示Gadd45a和Tgfb3上调，Il1a下调（P<0.05），而TFG2显示Gadd45a上调，Hspa1a和Il1a下调。TFG1和TFG2组均表现出cAMP信号通路中Grin3b的下调（P<0.05）。
Dpf3与调节能量代谢基因的SWI/SNF复合物相互作用，表明与产热有潜在联系。线粒体ATP合酶的亚基Atp5k和ND3对氧化磷酸化和ATP合成至关重要，这些过程与产热密切相关。这些结果表明，TFG通过调节关键基因表达来调节产热，可能影响线粒体功能和能量代谢。
13. 肝脏转录组、粪便代谢组和16s rRNA的综合分析
利用Spearman相关性，我们对差异表达的基因、与产热途径相关的代谢物和组间差异微生物进行了聚类热图分析。
如图15所示，Muribaculum intestinale与Atp5k和Gadd45a呈显著正相关，与Grin3b呈显著负相关。Atp5k基因与Muribaculum intestinale、乳球菌和乳酸乳球菌呈显著正相关。Dpf3基因与DG（90659302），DG（10:0/12:0/0:0:0），DG（18:3（9Z，12Z，15Z）/16:1（9Z）/0:0），DG（90659302），TG（14:0/14:1（9Z）/15:00），DG（9543716），TG（21:0/8:0/8:0），TG（18:0/18:3（6Z，9Z，12Z）/16:1（9Z））呈显著正相关。
图15 差异基因、代谢物和微生物群的相关性分析
14. 产热途径相关基因的RT-PCR分析
尽管转录组学和代谢组学分析没有显示产热途径显著富集，但粪便中TG、MG、DG和FFA水平降低。肝脏产热相关基因和途径的显著变化表明，TFG可能通过改变脂肪酸氧化和胰岛素敏感性间接激活产热。由于产热主要发生在BAT中，我们对小鼠背部脂肪组织中的产热相关基因进行了RT-PCR，以进一步研究TFG对脂肪代谢的调节机制。我们还检测到对棕色脂肪细胞形成重要的PRDM16和PGC1α。
如图16所示，与HFD组相比，TFG2组显著增加了AMPK、UCP1、PGC1α和PPARγ基因的表达，呈剂量依赖关系。先前的研究表明，茶能够通过产热途径调节脂肪代谢，包括上调UCP1和激活PPARγ/FGF21/AMPK/UCP1途径以消耗能量和减少脂肪积累。Xu等人发现，黄茶通过脂肪组织的异质性褐变刺激产热，涉及UCP1和PGC1α的上调。绿茶多糖通过增加UCP1和PGC1α的表达调节肠道微生物群以促进脂肪生热。
图16 背部脂肪组织中产热标志物（AMPK、UCP1、PGC1α、PRDM16和PPARγ）的相对mRNA表达水平。
AMPK-PGC1α通路是一种代谢传感器，调节脂肪细胞褐变和产热。Yamashita等人（2014）证明，黑茶通过AMPK-PGC1α途径增强BAT活性并诱导WAT褐变，从而减少肥胖。我们认为TFG中的茶褐素同样有助于降脂作用。Wang等人（2021）发现，茶褐素通过激活AMPK-PGC1α途径增强产热，增加BAT和WAT中UCP1的表达，这与我们的发现一致。因此，可以推断TFG主要通过AMPK-PGC1α途径增强产热，减少小鼠的脂肪积累。
结论
在这项研究中，我们采用了一种结合UPLC-MS/MS、GC-MS/MS和网络药理学的综合方法来量化和预测TFG中降脂的关键生物活性化合物；随后使用HFD小鼠模型证实了TFG的降脂功效。具体而言，TFG给药导致最终体重和体重增加减少。组织学检查进一步表明，TFG可以减少肝脏脂滴和附睾脂肪细胞的大小。此外，TFG显著增加了粪便中几种降脂细菌的丰度。粪便和肝脏样本的代谢组学和转录组学分析表明，TFG显著降低了富含产热途径的TG、DG、MG和FFAs的水平。关键基因，如Dpf3、Atp5k和ND3，受到差异调节。RT-PCR分析证实，TFG显著上调背侧脂肪中AMPK、UCP1、PGC1α和PPARγ的表达。基于这些发现，我们推断TFG通过AMPK-PGC1α途径增强产热，从而减少小鼠的脂肪积累。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996925004296?via%3Dihub
