研究前沿 | 利用基因组数据挖掘紫芝抗癌肽
癌症是一个重大的公共卫生问题，也是全球范围内导致死亡的主要原因之一。传统的化疗仍是治疗癌症的主要方法，但化疗药物对多药耐药性的频繁出现使得治疗变得复杂。基于具有生物活性的肽（尤其是抗癌肽，简称 ACPs）和蛋白质的新疗法已作为战胜癌症的有效策略出现。ACPs 是小肽，通常由少于 50 个氨基酸组成，其特性与抗菌肽（AMPs）相似。与细菌细胞表面类似，癌细胞表面带有负电荷，这可能解释了为什么许多 AMPs 对细菌和癌细胞都具有广谱毒性。我们先前构建的 DRAMP 数据库（http://dramp.cpu-bioinfor.org/）包含了超过 4000 种天然肽的数据，其中约 80 种（主要来自青蛙、蟾蜍和豌豆）具有抗癌活性。不幸的是，这些抗癌肽存在一些局限性，比如对正常细胞有毒性、在体内的半衰期较短以及口服生物利用度极低。还需要付出更多努力来寻找高效且低毒性的抗癌肽。
灵芝作为一种著名的中药，在中国和其他亚洲国家已被用作保健食品或药物来治疗各种疾病超过 2000 年。其抗癌活性已通过近期的药理学和临床前研究得到证实。各种灵芝属提取物和制剂已被证明能阻断癌细胞周期的不同阶段，并抑制多种类型癌细胞的生长。例如，从灵芝属中提取的三萜类化合物和β-葡聚糖对肿瘤细胞具有选择性细胞毒性作用，或者能激活免疫效应细胞，如 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞。灵芝提取物作为辅助疗法已被推荐用于癌症治疗。但关于灵芝属物种的大多数研究都集中在它们的多糖或潜在的小分子抗癌成分上，其可能存在的抗癌肽（ACPs）或蛋白质却未得到充分关注。本研究采用了基因组数据挖掘的方法，以期从紫芝（Ganoderma sinense）中发现潜在的抗癌肽。
从 NCBI 基因组数据库中获取了紫芝（G. sinense）的基因组和蛋白质组数据，其中包括超过 15000 条预测的蛋白质序列。这些蛋白质的长度分布情况如图 1 所示。大多数翻译出的蛋白质都含有超过 200 个氨基酸残基，只有 5.8% 的蛋白质（899 条序列）长度小于 100 个氨基酸。首先，我们试图从灵芝的蛋白质组中鉴定出具有抗癌活性的肽（ACP）；因此，通过 mACPpred 筛选出了长度小于100个氨基酸的蛋白质。灵芝基因组翻译出的蛋白质中没有被预测具有抗癌活性的，有可能实际上存在生物活性肽，但在其亲本蛋白质中是无活性的，只有在被酶切割后才会表现出活性。鉴于灵芝属物种被用作保健食品和药物，选择胰蛋白酶作为模型酶来水解蛋白质。
图1. 紫芝蛋白质组中的蛋白质长度分布
为了探究活性肽是否在灵芝属植物的药效中起着重要作用，本研究采用了一种基于生物信息学的（计算机模拟）方法，从紫芝（Ganoderma sinense）的基因组和/或蛋白质组数据中筛选出活性肽。尽管未发现任何由少于 100 个氨基酸组成的蛋白质具有抗癌活性，但这些蛋白质中有超过一半（477/899）具有潜在的活性肽序列，这是通过与已知的活性肽数据集进行比对而检测到的，并且有 65 个包含超过 4 个与已知活性肽相似的片段。这些灵芝蛋白质被用作亲本蛋白质。通过计算机模拟酶消化来确定亲本蛋白质在胰蛋白酶消化后是否释放出活性肽。经过胰蛋白酶消化的片段通过抗癌肽预测模型 mACPpred 进行筛选，该模型预测有 34 种蛋白质会释放出潜在的活性肽。随后与已知活性肽的序列相似性比较确定了 15 个胰蛋白酶消化后的片段可能是活性肽，其中 3 个序列与已知的活性肽相同。目前关于生物活性肽（BAPs）生物利用度的研究表明，这些肽能够以完整或活性的形式穿过人体的肠道屏障，进入血液循环系统。
图2. 实验流程图。（A）用已知的抗癌肽对 G. sinense 蛋白质进行 BLAST 搜索和比对。（B）命中序列示例。（C）命中序列通过胰蛋白酶的计算机模拟酶切进行切割。（D）通过mACPpred（一种基于SVM的算法）筛选消化片段，以识别推定的ACP。（E）然后将所得肽与已知ACP进行序列比较
此外，确定从中药中可能提取出的口服生物可利用的抗肿瘤肽也颇具意义，因为大多数中药都是通过口服方式给药的，这对于癌症患者可能有益。而且，由于化学合成和纯化技术的发展，肽类物质，尤其是短肽，可以通过化学合成获得，例如临床上使用的药物奥曲肽和亮丙瑞林。我们通过这种方法发现的潜在抗肿瘤肽可以根据其生物利用度选择通过静脉注射或口服方式进行合成和给药。
大多数抗癌肽（ACP）是由抗菌肽（AMP）衍生而来；因此，抗癌肽与抗菌肽具有相似的特性。与细菌细胞的表面一样，癌细胞的表面也带有负电荷，这或许可以解释为什么许多抗菌肽对细菌和癌细胞都具有广谱毒性。据信，抗癌肽与癌细胞质膜上带负电荷的成分之间的静电相互作用在抗癌肽的癌细胞选择性毒性中起着至关重要的作用。在本研究中，我们发现 15 种假定的抗癌肽中有 8 种是带正电荷的，而两种假定的抗癌肽的结构表明存在一个α螺旋，这可能类似于可以插入细胞膜的抗菌肽。结果还表明，并非所有假定的抗癌肽都是带正电荷的。这些结果意味着除了与质膜上带负电荷的成分相互作用外，还存在其他抗癌机制。
与我们研究中所采用的策略类似的方法，可以应用于从其他中草药中寻找具有生物活性的肽段。近年来，测序方法和蛋白质组学研究技术（包括二维电泳和质谱分析）的发展，使得大量的基因组和蛋白质组数据得以积累，为我们从新的角度探索中草药资源提供了机会。
原文发表于：Phytochemistry Volume 179, November 2020, 112466 DOI: 10.1016/j.phytochem.2020.112466
