文献分享｜可食用牛肝菌中可溶性半乳聚糖的结构解析及其对肠道菌群的影响
【文章信息】
发表时间：2026年1月
期刊：Carbohydrate Polymers（碳水化合物聚合物）
影响因子：IF=10.1
最高JCR分区/中科院分区：Q1 / 工程技术 1 区
题目：Structural elucidation and effects on gut microbiota of soluble galactans from edible Boletus
DOI：https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2026.124886
【研究背景】
云南省被誉为野生菌王国，盛产牛肝菌等多种珍贵野生食用菌。其中，近黑新牛肝菌和黄粉牛肝菌因风味独特、具有潜在健康促进作用而成为代表性可食用菌种。现代药理研究表明，牛肝菌提取物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和抗肿瘤活性，凸显其健康应用潜力。然而，目前研究主要集中在生物活性小分子上，而多糖由于结构复杂，相关研究仍面临重大挑战。
肠道健康在整体生理、免疫和代谢功能中发挥基础性作用。肠道健康很大程度上依赖肠道菌群的稳态。多糖作为生物活性物质，在建立和维持这种平衡中起关键作用。多糖的结构特征（包括分子量、单糖组成、糖苷键类型）可显著影响肠道菌群的组成和空间结构。结构不同的多糖发酵后产生的代谢物在种类和丰度上存在显著差异。这些微生物代谢物（尤其是短链脂肪酸 SCFAs）随后通过复杂的反馈机制和宿主‑微生物信号通路调节宿主生理功能。
在野生食用菌牛肝菌的生物活性分子中，多糖可能对人体具有潜在健康益处。然而，目前仍存在显著的研究空白，尤其是新型牛肝菌多糖调节肠道菌群的具体代谢过程。
本研究以近黑新牛肝菌和黄粉牛肝菌多糖为对象，表征其结构特性并评估对肠道健康的影响。通过柱层析纯化多糖，分析其组成、结构和流变学特性；开展体外发酵实验评估对有益菌株生长的影响；测定SCFAs产生和肠道菌群整体组成；利用宏基因组分析肠道菌群结构和关键CAZymes；随后采用分子对接模拟研究与CAZymes的特异性互作模式。本研究结果有望加深对牛肝菌多糖结构和健康促进作用的理解，为开发靶向调节肠道菌群的益生元提供理论参考。
【研究内容】
1 分离与化学表征
通过热水提取、乙醇沉淀和柱层析，从近黑新牛肝菌和黄粉牛肝菌子实体中分离得到两种新型多糖NBP和BRP（（见图1A））。苯酚‑硫酸法测定显示，NBP总糖含量为93.2±0.55%，BRP为91.8±0.29%。HPLC分析显示两种聚合物均为对称单峰洗脱曲线，表明均一性高（见图1B、C）。NBP的Mw和Mn分别为16.1和13.7 kDa，BRP分别为14.2和11.7 kDa（见图1D、E）。此外，通过GPC‑MALS测定的绝对分子量略低（NBP：Mw 13.8 kDa，Mn 13.0 kDa；BRP：Mw 11.6 kDa，Mn 11.4 kDa），反映相对流体力学体积与绝对分子量测定之间的差异（见图1F、G）。
图1 | NBP与BRP的提取、纯化及结构表征。（A）分离纯化流程示意图；（B）NBP的HPLC色谱图；（C）BRP的HPLC色谱图；（D）NBP的HPGPC图谱；（E）BRP的HPGPC图谱；（F）NBP的GPC‑MALS图谱；（G）BRP的GPC‑MALS图谱；（H）单糖组成分析；（I）部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAAs）总离子流图。
2 单糖组成与甲基化分析
采用PMP柱前衍生和HPLC分析NBP和BRP的单糖组成，通过与标准品保留时间对比鉴定（见图1H）。具体而言，NBP由甘露糖、岩藻糖、半乳糖组成，摩尔比1.0:1.2:3.8。相比之下，BRP由葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、半乳糖组成，摩尔比1.0:3.1:2.8:14.9。基于这些结果，半乳糖被确定为两种多糖的主要糖组分。
基于甲基化分析（见图1I、表1），在NBP和BRP中分别鉴定出5种和6种糖苷键类型。值得注意的是，两种多糖共有4种连接方式：末端岩藻糖、末端甘露糖、→6）‑Galp‑（1→、→2,6）‑Galp‑（1→。相比之下，→3）‑Fucp‑（1→仅存在于NBP中，而末端葡萄糖和→4）‑Manp‑（1→仅在BRP中鉴定到。→4）‑Manp‑（1→和→4）‑Galp‑（1→的衍生物在BRP所用GC柱上可能共洗脱（见图S2）。→6）‑Galp‑（1→和→2,6）‑Galp‑（1→的衍生物不与其他糖的类似衍生物共洗脱。因此可合理将4‑连接归为甘露糖。这些结果共同表明，NBP和BRP均具有由α‑1,6‑连接的半乳吡喃糖残基组成的主链，并在O‑2位发生取代，结构多样性来源于侧链取代基的差异。
表1 | NBP和BRP甲基化产物的GC–MS信号归属
3 NMR分析
通过NMR光谱解析纯化多糖的结构。采集并归属NMR光谱，包括¹H、¹³C、COSY、HSQC、HMBC、TOCSY、HSQC‑TOCSY、ROESY（见图2、图S3、表2）。
表2 | 多糖NBP和BRP的¹H与¹³C NMR化学位移（δ：ppm，J：Hz，重水溶剂中）
3.1 NBP的NMR光谱分析
NBP的¹H NMR光谱在δH 5.13、5.12、5.07、5.01 ppm处显示特征异头信号（见图2A）。¹³C NMR光谱在δC 104.41、105.25、105.26、100.74、101.07 ppm处显示异头碳信号（见图2B）。基于甲基化分析和二维NMR（COSY、HSQC、HMBC、ROESY），主要残基鉴定为→6）‑α‑D‑Galp‑（1→（A）、→2,6）‑α‑D‑Galp‑（1→（A′）、t‑α‑L‑Fucp（B）、→3）‑α‑L‑Fucp‑（1→（B′）、t‑α‑D‑Manp（C）。
通过HMBC确定糖苷键模式（见图2D），结果显示A的C‑6（δC 69.34）与A′的H‑1（δH 5.07 ppm）之间、A′的C‑6（δC 69.84）与A的H‑1（δH 5.01 ppm）之间存在关键关联，表明主链由→6）‑α‑D‑Galp‑（1→残基组成。其他HMBC关联进一步支持侧链拓扑：A′的C‑2（δC 80.38）与B的H‑1（δH 5.13）或C的H‑1（δH 5.13）之间的交叉峰表明B和C均连接于A′的C‑2位；B′的C‑1（δC 105.26）与A′的H‑2（δH 3.84）之间的关联证实B′连接于A′的C‑2位；B′的C‑3（δC 80.42）与B的H‑1（δH 5.13）或C的H‑1（δH 5.12）之间的关联表明B′连接于B和C的C‑3位。
综合单糖组成、甲基化分析和多维NMR数据，确定NBP具有新型多糖结构：由α‑1,6‑连接的半乳吡喃糖残基组成，在A′残基的O‑2位具有异质侧链，包括t‑α‑L‑Fucp、t‑α‑D‑Manp和→3）‑α‑L‑Fucp‑（1→，后者在O‑3位进一步被t‑α‑L‑Fucp或t‑α‑D‑Manp取代，如图3A所示。
图2 | NBP和BRP的NMR图谱。（A）NBP和BRP的¹H NMR谱（蓝色为NBP，紫色为BRP）；（B）NBP和BRP的¹³C NMR谱（蓝色为NBP，紫色为BRP）；（C）NBP的¹H‑¹³C HSQC谱；（D）NBP的¹H‑¹³CHMBC谱；（E）BRP的¹H‑¹³C HSQC谱；（F）BRP的¹H‑¹³C HMBC谱。
3.2 BRP的NMR光谱分析
BRP的¹H NMR光谱在δH 5.12、5.07、5.00、4.54、4.53 ppm处显示异头质子信号（见图2A）。¹³C NMR光谱在δC 104.38、105.07、105.19、105.57、100.94、101.19 ppm处显示异头碳信号（见图2B）。甲基化和二维NMR分析鉴定出残基→6）‑α‑D‑Galp‑（1→（A）、→2,6）‑α‑D‑Galp‑（1→（A′）、t‑α‑L‑Fucp（B）、t‑α‑D‑Manp（C）、→4）‑α‑D‑Manp‑（1→（C′）、t‑β‑D‑Glcp（D）、t‑β‑Me‑D‑Glcp（D′）。
通过HMBC和ROESY实验确定糖苷键。关键HMBC关联（见图2F）：A的C‑6（δC 69.33）与A′的H‑1（δH 5.07 ppm）之间、A′的C‑6（δC 69.37）与A的H‑1（δH 5.00 ppm）之间，表明主链由→6）‑α‑D‑Galp‑（1→残基组成。此外，A′的C‑2（δC 80.92）与B的H‑1（δH 5.08）、C的H‑1（δH 5.12）、C′的H‑1（δH 5.12）之间的交叉峰表明残基B、C、C′连接于A′的C‑2位。C′的C‑4（δC 80.38）与C的H‑1（δH 5.12）之间的额外关联表明C连接于C′的C‑4位。ROESY光谱显示D的H‑1（δH 4.54）与A′的H‑2（δH 3.85）之间存在交叉峰，表明D与A′之间存在连接。
综合单糖组成、甲基化分析和多维NMR数据，确定BRP具有α‑1,6‑连接的半乳吡喃糖残基主链，在A′残基O‑2位被异质侧链取代，包括t‑α‑L‑Fucp、t‑α‑D‑Manp、t‑β‑D‑Glcp、t‑β‑Me‑D‑Glcp和→4）‑α‑D‑Manp‑（1→，后者在O‑4位进一步被t‑α‑D‑Manp取代。因此，BRP被鉴定为新型多糖，结构如图3B所示。
图3 | 分别来自近黑新牛肝菌的NBP（A）与黄粉牛肝菌的BRP（B）的推测结构
4 紫外和FT‑IR光谱分析
NBP和BRP多糖的紫外‑可见吸收光谱在260 nm或280 nm（核酸和蛋白质特征波长）处无明显吸收，证实多糖制剂纯度高。
NBP和BRP的FT‑IR光谱显示特征吸收峰：3430 cm⁻¹处宽强峰归属于O‑H伸缩振动；2929 cm⁻¹处弱峰归属于糖类C–H伸缩振动；1645 cm⁻¹处信号与结合水相关；1410 cm⁻¹附近低强度峰表明C‑H弯曲；1132 cm⁻¹处显著信号为吡喃糖形式特征；1070 cm⁻¹处强峰对应C‑O‑C糖苷键伸缩；820 cm⁻¹处诊断峰证实α‑糖苷键存在。
5 多糖的流变学特性和微观结构
5.1 流变学特性
在时间扫描测试中（1%应变，1 Hz），NBP表现出时间依赖性响应，初始模量上升后松弛，与BRP在50 min内观察到的稳态G′和G*值形成鲜明对比（见图4A、D）。
在稳态剪切下，两种多糖溶液（5 mg/mL，25℃）均表现出假塑性行为（见图4B、E），符合幂律模型。BRP在高剪切速率下黏度更高，而NBP零切黏度略高。BRP流变强度增强归因于甘露糖侧链促进缠结和瞬时交联，导致黏度、弹性和时间稳定性提升。这些特性使BRP更适用于增稠或结构化体系，而NBP柔性可逆网络更适合可流动配方。
频率扫描测量（0.1–100 rad/s）揭示两种多糖溶液的独特黏弹性特征（见图4C、F）。BRP和NBP均表现出弱凝胶行为，G′和G*随频率增加而上升。在低频率下，G''>G′表明以黏性为主，而高频率下G′>G''反映弹性占优。BRP模量显著更高且增长更陡，表明分子间相互作用更强、缠结网络更致密。
BRP和NBP的独特流变行为源于结构差异。尽管NBP含有丰富的甘露糖取代，但其较低黏度表明甘露糖含量本身不决定宏观流变性质。BRP更优的黏弹性更可能与其含甘露糖侧链的长度、结构和连接性相关，这些侧链有利于分子间缠结和瞬时网络形成。总体而言，BRP中的甘露糖修饰可能有助于其在设计质构食品和控制产品稳定性方面的优越功能。
图4 | NBP和BRP的流变学表征及透射电镜图。（A）NBP的时间扫描分析；（B）NBP的稳态剪切流动曲线；（C）NBP的频率扫描；（D）BRP的时间扫描分析；（E）BRP的稳态剪切流动曲线；（F）BRP的频率扫描；（G）NBP的透射电镜图（标尺：1μm）；（H）NBP的透射电镜图（标尺：500 nm）；（I）BRP的透射电镜图（标尺：1μm）；（J）BRP的透射电镜图（标尺：500 nm）。
5.2 微观结构
TEM图像（见图4G–J）揭示明显构象差异：NBP呈均匀分散、支链稀疏的线性链（5–10 nm），缠结有限；而BRP呈现致密聚集网络，特征为广泛物理缠结和连接点局部增厚（8–15 nm）。
6 半乳聚糖对肠道菌群组成的调控作用
为评估半乳聚糖的益生元潜力，分析其对肠道菌群组成和结构的影响。基于Chao1指数的Alpha多样性分析表明，菊粉、NBP、BRP组微生物群落丰富度大致相似（见图5A），而Shannon指数显示多样性存在显著差异（见图5B）。值得注意的是，半乳聚糖添加显著富集关键有益菌属，尤其是片球菌属和双歧杆菌属（见图5C）。物种水平分析（见图5D）和LEfSe分析证实这些类群为干预主要生物标志物（见图5F）。
此外，FDR校正的Kruskal–Wallis检验证实几种关键产丁酸物种显著增加，包括普拉梭菌和柔嫩梭菌（见图5E）。干预还促进益生菌物种增殖，如植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌。同时，观察到富含多糖利用位点（PULs）的细菌显著扩增，包括单形拟杆菌、克里斯滕森菌科R‑7群和解木聚糖拟杆菌，表明肠道生态系统中多糖代谢能力增强。这些细菌被认为对肠道微生态和宿主免疫有益。
尽管NBP和BRP整体益处相似，但它们在促进特定片球菌和双歧杆菌菌株以及富集具有不同PUL谱的菌群方面表现出细微差异。这些差异可能归因于BRP更高的半乳糖含量、侧链独特的糖苷键和相对较低的分子量。以往研究表明，更高的半乳糖含量和更低的分子量通常提高多糖的可降解性和肠道菌群利用率，从而增强有益效果，与本研究结果一致。总体而言，结果表明NBP和BRP具有开发为益生元的巨大潜力。
图5 | NBP和BRP体外发酵过程中微生物群落组成与结构。（A）物种水平Chao1指数；（B）物种水平Shannon指数；（C）属水平相对丰度；（D）物种水平相对丰度；（E）群落组成差异分析；（F）差异类群的进化分支图。
7 多糖对益生菌生长的影响
宏基因组注释结果表明牛肝菌多糖可促进特定益生菌增殖（见图5）。这些结果提出问题：这种增殖效应是通过直接利用多糖产生，还是通过微生物网络调控或代谢物刺激间接诱导？因此，开展体外实验研究这些多糖对益生菌增殖的直接刺激作用。用于验证的益生菌菌株主要基于宏基因组注释结果：乳酸片球菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌。
发酵结果表明，NBP和BRP均显著促进三种受试益生菌增殖（见图6）。值得注意的是，BRP在刺激这些菌株生长方面优于普通碳源（葡萄糖）和经典益生元（菊粉）。尽管BRP上生长增强的确切机制尚待完全阐明，但可能归因于特定结构特征，尤其是侧链独特的糖苷键或相对较低的分子量。以往研究表明此类结构特征具有调节肠道菌群组成和改善肠道微生态的潜力。
关于增殖动力学，在葡萄糖、菊粉或半乳聚糖（NBP/BRP）上培养的所有菌株的生长曲线均呈现典型S形，与基本细菌种群动态一致。所有培养物在接种后约24 h达到稳定期，表明底物利用和代谢副产物积累之间的动态平衡。综上，结果表明牛肝菌半乳聚糖可直接且选择性刺激益生菌增殖，表明其作为靶向调节肠道菌群的益生元潜力。
图6 | 多糖对益生菌的促生长作用。（A）乳酸片球菌生长曲线；（B）乳酸片球菌孵育后NBP的HPLC图；（C）乳酸片球菌孵育后BRP的HPLC图；（D）动物双歧杆菌生长曲线；（E）动物双歧杆菌孵育后NBP的HPLC图；（F）动物双歧杆菌孵育后BRP的HPLC图；（G）婴儿双歧杆菌生长曲线；（H）婴儿双歧杆菌孵育后NBP的HPLC图；（I）婴儿双歧杆菌孵育后BRP的HPLC图。
8 发酵过程中pH、SCFAs和乳酸的变化
接下来研究牛肝菌半乳聚糖对肠道微环境的潜在调控作用，重点关注微生物代谢产物（包括SCFAs和乳酸）和发酵液pH的变化（见图7A、B、D、E）。SCFAs（包括乙酸、丙酸、丁酸）是膳食纤维微生物发酵的主要代谢产物。除作为结肠细胞主要能量来源外，已知SCFAs通过受体介导通路调节宿主代谢、免疫反应和屏障完整性，与癌症、炎症性疾病和代谢性疾病相关。
本研究中，与菊粉相比，半乳聚糖添加与总SCFAs含量大幅升高及各组分含量增加相关（见图7C、F–H）。具体而言，BRP组总SCFAs含量为菊粉组的1.68倍，乙酸、丙酸、丁酸浓度分别为菊粉组的1.67、1.86、1.61倍。作为SCFAs关键代谢前体，乳酸在BRP干预后也显著升高，达到菊粉组的1.77倍。这种升高与片球菌等产乳酸细菌的显著富集一致（见图5E）。SCFAs和乳酸浓度升高可能导致观察到的发酵液pH降低（见图7B）。这种酸化可能通过形成有利于耐酸有益菌属（如片球菌、双歧杆菌、乳杆菌属）增殖的条件，同时抑制酸敏感生物，在塑造微生物群落结构中发挥作用。
因此，结果表明牛肝菌多糖可促进乳酸和SCFAs产生并诱导肠道pH降低，与肠道菌群组成的有益改变一致。这些特性支持其作为改善肠道健康的微生态调节剂的潜在用途。
图7 | 半乳聚糖发酵过程中pH、短链脂肪酸（SCFAs）和乳酸谱的动态变化。（A）混合SCFA标准品的代表性GC–MS色谱图；（B）发酵液pH动力学；（C）总SCFA产量；（D）总乳酸积累量；（E）乳酸代表性色谱图；（F）乙酸含量；（G）丙酸含量；（H）丁酸含量。
9 微生物系统中驱动半乳聚糖代谢的核心CAZymes
上述结果表明牛肝菌半乳聚糖可被肠道菌群降解。本研究整合宏基因组测序与分子模拟，阐明半乳聚糖（BRP/NBP）如何被肠道微生物利用。宏基因组注释显示降解过程涉及多种碳水化合物活性酶（CAZymes），包括糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）、碳水化合物酯酶（CEs）、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物结合模块（CBMs）和辅助活性酶（AAs）（见图8A、C）。其中，GHs和PLs直接切割糖苷键；值得注意的是，GHs占总CAZymes的70%以上，表明其在半乳聚糖代谢中占主导地位。在GH家族中，GH2和GH1丰度特别高（见图8E、F），表明其作为降解过程核心成员的潜在作用。GH97、GH43、GH77、GH95和GH36也可能参与协同降解。
微生物溯源进一步显示这些CAZymes主要来源于拟杆菌科，拟杆菌属和Phocaeicola被鉴定为编码主要降解酶的关键微生物类群（见图8B、D），可能是降解过程的主要驱动者。
采用Glide‑SP方案进行分子对接模拟（见图8G、H），探索牛肝菌半乳聚糖与代表性糖苷水解酶之间的潜在结合模式。模拟预测区域I和区域IV分别与1BGA和1DP0受体表现出良好的相互作用模式。具体而言，对于区域I，观察到与1BGA关键残基（ASN222、THR242、SER299、ALA307、LEU310、GLU405）形成多个氢键（见图8G），而区域IV与1DP0形成类似氢键网络（见图8H）。
总之，这些氢键辅以CH–π相互作用，预计将配体锚定在富含极性残基的α‑螺旋和β‑折叠之间的浅槽中，形成互补的酶‑底物相互作用（见图8G、H、图S6）。值得注意的是，α‑半乳糖苷酶（1SZN）、β‑葡萄糖苷酶（1BGA）、β‑葡萄糖醛酸酶（4JKK）和β‑半乳糖苷酶（1DP0）对1,6‑连接的半乳聚糖主链表现出较高的预测亲和力，表明对主链识别的潜在偏好。此外，半乳聚糖羟基与周围残基之间形成的广泛氢键网络可稳定底物处于有利于酶结合的构象；这可能有助于将目标糖苷键定位在催化口袋内，从而为可能的水解活性提供结构依据。
综上，数据表明牛肝菌半乳聚糖主要被拟杆菌科成员（如拟杆菌属和Phocaeicola）降解，利用分泌的糖苷水解酶（尤其是GH2和GH1）作为主要降解系统。关键的是，分子相互作用表明这些GHs对多糖不同结构区域具有独特的结合偏好。尽管对接模型提出了底物识别和催化前定位的结构假说而非催化直接证据，但这些发现代表需要实验验证以确认实际切割模式和酶活性的理论预测。
图8 | 参与半乳聚糖降解的关键微生物类群与核心CAZymes。（A）NBP降解过程中CAZymes相对丰度；（B）主要肠道微生物类群对NBP降解的贡献；（C）BRP降解过程中CAZymes相对丰度；（D）主要肠道微生物类群对BRP降解的贡献；（E）参与半乳聚糖降解的主要CAZymes家族；（F）CAZymes互作弦图；（G）结构区域I与β‑葡萄糖苷酶的相互作用；（H）结构区域IV与β‑半乳糖苷酶的相互作用。
【结论】
本研究首次从可食用真菌近黑新牛肝菌和黄粉牛肝菌中分离并结构表征两种新型半乳聚糖（NBP、BRP），并研究其结构特征和与肠道菌群的相互作用。结果表明，尽管两种多糖均表现出低黏度，但BRP可形成剪切稳定的弹性凝胶网络，而NBP以线性结构为主。体外发酵实验证实其生物刺激潜力，肠道菌群研究进一步显示优异的益生元功效，尤其促进益生菌（如乳酸片球菌、动物双歧杆菌乳亚种、婴儿双歧杆菌）增殖，优化微生物群落结构，并显著富集产丁酸菌（如普拉梭菌）。
在代谢水平，两种多糖均激活SCFAs生物合成途径，大幅提高乙酸、丙酸、丁酸产生，同时降低发酵pH，从而有助于肠道微生态平衡和宿主能量稳态。宏基因组分析确定拟杆菌科（主要为拟杆菌属和Phocaeicola）为负责降解这些半乳聚糖的关键功能类群，由大量GHs分泌驱动，GH2和GH1家族作为核心酶，占相关CAZyme丰度的70%以上。分子对接进一步阐明核心GHs与底物之间的特异性结合机制。
综上，这些发现表明牛肝菌多糖有望作为改善肠道健康的益生元或补充剂，并为精准营养干预提供初步理论基础。
【期刊介绍】
《Carbohydrate Polymers》发表关于碳水化合物聚合物的基础和应用研究，涵盖其结构、性质、功能以及在食品、医药、材料等领域的应用。期刊关注碳水化合物聚合物的创新研究，包括其提取、分离、纯化、结构鉴定、改性以及生物活性等方面。研究的重点是碳水化合物聚合物的化学、物理和生物学特性，以及它们在不同环境中的行为和应用。期刊要求稿件具有明确的研究目的和创新性，提供详细的实验方法和结果分析，对碳水化合物聚合物的科学和应用具有重要贡献。
期刊网址：
www.elsevier.com/locate/foodchem
