编码蔗糖代谢酶的scr基因簇的获得使副溶血弧菌和创伤弧菌菌株能够利用蔗糖作为碳源

  摘要：大多数副溶血性弧菌菌株都不能利用蔗糖作为碳源，我们通过全基因组测序(WGS)研究了一株蔗糖阳性副溶血性弧菌菌株，并证实了含有蔗糖利用基因的基因组岛的存在。PCR扩增由三个基因组成的4.7kb DNA簇：编码蔗糖摄取蛋白的scrA、编码果糖激酶的scrK和编码蔗糖-6-磷酸水解酶的scrB，并将其插入到弧菌/大肠杆菌穿梭载体pVv3中。两个重组质粒仅在插入物相对于pVv3-lacZα片段的方向上不同，赋予大肠杆菌K12转化体利用蔗糖的能力。将这两种质粒引入蔗糖阴性副溶血性弧菌和创伤弧菌菌株中也会导致蔗糖利用表型从阴性变为阳性。通过对scrA、scrK和scrB进行多重PCR，从我们收集的零售菌株中检测到43株scr阳性副溶血性弧菌，并证实其能够使用蔗糖作为碳源。为了深入表征，对17株蔗糖阳性副溶血性弧菌进行了WGS。在所有菌株中鉴定出一个核苷酸同一性>95%的基因组岛，包含scrA、scrB、scrK和三个额外的编码序列(CDS)。另外的基因被预测为编码转录调节器的基因(scrR)、编码孔蛋白的基因和功能未知的CDS。序列比较表明，在所有分析的副溶血性弧菌菌株中，基因组岛位于染色体II的相同区域。将基因组与蔗糖利用物种溶藻弧菌的序列进行结构比较，发现了相同的基因组岛，这表明这种遗传结构可能通过水平基因转移而分布。基于SNP差异的所有基因组序列的比较表明，在遗传多样的副溶血性弧菌菌株中发现了蔗糖利用基因的存在，并且不限于密切相关菌株的子集。

  副溶血弧菌16-VB00198中蔗糖利用(scr)基因簇的鉴定

  16-VB00198通过MALDI ToF MS和PCR靶向toxR被分配给副溶血性弧菌。

  当用API20E条测试时，该菌株的蔗糖利用率为阳性。此外，当在蔗糖肉汤中生长时，它的颜色从蓝色变为黄色，这表明它能够利用蔗糖作为唯一的碳源。

  全基因组测序和ANI计算显示16-VB00198与副溶血性弧菌型菌株ATCC17805(WDCM00037)之间的同源性为98.2%。

  通过使用已发表的蔗糖代谢相关基因进行BlastN搜索，确定了一个由三个scr基因组成的CDS簇。含有溶藻弧菌scrA和scrB基因的蔗糖摄取区的核苷酸序列(登录号M30194)显示出与16-VB00198的DNA区(contig_16)97%的核苷酸同一性。进一步的生物信息学分析表明，该菌株包含一个蔗糖利用基因簇，该簇包含三个基因(scrA、scrK和scrB)，它们首尾相连，排列顺序为50-30。scrA基因编码磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统(PTS)的蔗糖摄取蛋白，scrK编码果糖激酶，scrB编码蔗糖-6-磷酸水解酶。scrA上游有一个编码转录调节因子的基因，其编码序列与scrA反向。

  大肠杆菌scrAKB基因簇的克隆

  为了检查scrA-scrK-scrB簇的功能，使用分别含有限制性位点HindIII和BamHI的正向和反向引物，用高保真TM DNA聚合酶通过PCR扩增该区域。用两种限制性酶消化4656bp的PCR片段，并与高拷贝数大肠杆菌克隆载体pUC18(AmpR)的BamHI/HindIII切割的DNA连接。大肠杆菌K12转化后，从氨苄青霉素抗性转化体中分离出具有scr区的重组质粒。

  经验证的pUC18(scrAKB)衍生物用于将16-VB00198 scrA scrK scrB簇重新克隆到弧菌/大肠杆菌穿梭载体pVv3(KmR)。最后，通过对卡那霉素抗性大肠杆菌K12的筛选，获得了两个源自pVv3的重组质粒。两种质粒在插入的scr片段相对于lacZα-片段的转录方向的方向上不同(图1)，并通过商业桑格测序进一步验证。在重组质粒pC50中，来自pVv3多克隆位点的30bp BamHI HindIII片段插入scr片段的两侧，导致scr基因和lacZα-片段的转录方向相反。相反，pC98显示scr基因和lacZα片段的转录方向相同。根据文献在克隆片段中推断出两个启动子和三个转录终止子序列(图1B)，目前尚未通过实验验证。

  scr基因簇在大肠杆菌和弧菌中的表达

  大肠杆菌K12菌株不能利用蔗糖。然而，在将溶藻弧菌scr基因簇引入大肠杆菌K12后，克隆能够代谢蔗糖。在蔗糖肉汤中测试了副溶血性弧菌16-VB00198的scr基因在大肠杆菌K12中的表达。虽然携带载体pVv3的原始菌株(GeneHogsTM)及其衍生物对蔗糖利用呈阴性，但含有重组质粒pC50或pC98的转化体能够代谢二糖(图2A)。为了确认大肠杆菌K12转化体，使用特异性引物应用靶向scrA、scrB和scrK的多重PCR(表3)。PCR扩增产生预期大小的PCR产物(图2B)。

  为了测试蔗糖阴性副溶血性弧菌和创伤弧菌是否可以转化为利用糖，使用为pVv3开发的方案，通过电穿孔将质粒pC50或pC98引入所选菌株。在转化三种弧菌菌株(表1)后，通过在蔗糖肉汤中生长测试了卡那霉素抗性转化体的蔗糖利用率(图2A)。两种副溶血性弧菌菌株(BfR-VB00009和BfR-VB 00016)和创伤弧菌菌株BfR-VB00034的转化体显示能够代谢糖。scrABK基因的存在也通过scr多重PCR得到证实(图2B)

  蔗糖阳性副溶血弧菌菌株中scr簇的存在

  为了确定scr基因簇在我们的培养物中的弧菌菌株中的出现，使用上述scr多重PCR对多个蔗糖阳性副溶血弧菌菌株进行PCR应用。共有43株蔗糖阳性菌株通过生化检测发现scr基因的存在。从所有蔗糖阳性菌株中获得了三种预期的PCR产物，证实了scr DNA区域的存在。此外，通过PCR检测了10株蔗糖阴性副溶血性弧菌菌株，但未产生任何可见的PCR产物，证实PCR对scr基因簇的检测具有特异性。

  蔗糖阳性副溶血弧菌菌株的遗传多样性

  进行全基因组测序，以确定蔗糖簇是否仅限于一小群遗传相关的副溶血性弧菌菌株。从我们收集的来自不同地理来源、宿主动物和分离时间点的17个蔗糖阳性菌株被选择用于进一步分析其遗传基础，根据它们的系统发育关系和scr区域分析了菌株的基因组。WGS显示菌株的基因组大小在4.9和5.9 Mb之间变化。对所有17个菌株的MLST分析表明，一些菌株属于相同的MLST序列类型(ST)，然而，发现了几个不同的持家基因等位基因。

  使用最大似然法分析包含scrA、scrK和scrB基因编码序列的基因组区域，包括基因间序列(共4027 bp)。将序列分配给三个簇，用不同的颜色表示(图3，左半部分)。菌株scr区的核苷酸同源性在95.8和100%之间。

  为了确定菌株的系统发育关系，选择16-VB00198的基因组作为SNP分析的参考。CSI系统发育用于17个蔗糖阳性菌株中的SNP树生成(见图3，右半部分)。所有分离株覆盖的参考基因组的百分比为73.59%，因此4359330个核苷酸代表SNP比较的基础。

  SNP树显示了蔗糖阳性菌株之间的明显差异，因为SNP计数范围在7和40506之间。菌株16-VB00184、16-VB00204、17-VB00364和17-VB00065与所有其他菌株之间的差异超过35000个SNPs。

  WGS还发现，许多SNP计数差异较小的菌株是密切相关的菌株。根据副溶血性弧菌pubMLST方案，这些菌株可能属于相同但未分配的多位点序列类型(ST)。

  正如预期的那样，属于同一个ST的菌株高度相同，并且表现出scrAKB区仅在几个核苷酸上不同。总之，基于SNP差异的所有基因组序列的比较表明，蔗糖利用基因的存在存在于遗传多样的菌株中，并不局限于密切相关菌株的子集。

  此外，使用16-VB00198的基因组作为参考，计算所有菌株的ANI值。与参考值相比，ANI值在98.19%和98.42%之间。

  菌株17-VB00250的基因组与参考基因组100%相同，对应于SNPs的低差异(仅七个SNPs)。ANI值如图3所示，但其显著性低于SNP分析。

  副溶血弧菌基因组中scr基因簇的整合位点

  我们将副溶血弧菌16-VB00198菌株的scrAKB区与溶藻弧菌参考菌株ATCC 33787(登录号CP013485)的基因组进行了比较。一般来说，这两种弧菌属于哈维弧菌分支，蔗糖利用已被用作这些细菌生化分化的重要表型特征。两种弧菌基因组的scr区的比较如图4A所示。克隆的区域是基因组岛的一部分，可能是通过溶藻弧菌的水平基因转移获得的。在该物种中，所有菌株均为蔗糖阳性，而在副溶血性弧菌中，99%的菌株无法利用蔗糖。在副溶血弧菌16-VB00198中，蔗糖基因scrA、scrK和scrB是约8.0kb基因组岛的一部分。该岛与溶藻弧菌区域的总体核苷酸相似性大于95%。有趣的是，scr基因簇的位置被确定在溶藻弧菌和副溶血弧菌的染色体II的相同位置。在scr基因组岛的侧翼序列中，两个物种的染色体DNA序列之间的相似性降至约70%。

  已鉴定的scr岛在两种物种中都包含额外的编码序列(CDS)：scrR，一种编码scrA上游的假定转录调节因子的基因，一种可能参与双糖摄取的孔蛋白基因，以及一种假定蛋白的CDS。所有岛屿基因的转录方向如图4A所示。在scrB基因的下游，基因组岛以一个短的假基因序列(110bp)结束，该序列源自一个编码二氢叶酸还原酶的基因。在scr基因组岛的5’端，两种菌株中都存在编码代谢酶的相同基因(岛的上游是一个ß-酮酰基ACP还原酶基因)。在副溶血弧菌岛的3’端，溶藻弧菌染色体基因的第一个常见基因是编码S-谷胱甘肽转移酶的基因。

  溶藻弧菌ATCC 33787中存在于基因组岛scrB基因和S-谷胱甘肽转移酶基因之间的两个基因在副溶血弧菌16-VB00198中缺失。在蔗糖阳性副溶血性弧菌菌株的17个基因组中，相同的基因排列是保守的。副溶血性弧菌菌株中scr基因组岛及其侧翼染色体区的总体核苷酸同一性高于97%。计算每个副溶血性弧菌基因组scr岛8kb区域的GC含量(假设基因的起始密码子到scrB基因的终止密码子)，并与相应全基因组的GC含量进行比较。在所有17种情况下，scr岛的GC含量比整个基因组的GC含量低1.5%。这一结果支持了通过水平基因转移获得scr岛的假设。

  我们还对溶藻弧菌ATCC 33878(登录号CP013485;核苷酸位置1012100至1027000)的染色体scr区与其他已发表的溶藻弧菌基因组进行了BlastN搜索。在一些溶藻弧菌菌株中，该区域包含相同数量和相同排列的基因，如图4A所示。然而，在各种其他溶藻弧菌菌株中，scrB和S-谷胱甘肽转移酶基因之间的两个基因缺失。

  此外，我们还对蔗糖阴性副溶血性弧菌菌株的相应染色体II区中存在哪些基因感兴趣(图4B)。该基因组区域在菌株之间显示出更大的遗传变异性。在编码ß-酮酰基ACP还原酶的基因下游，两个编码未知功能蛋白质的保守基因在分析菌株中很常见(由深灰色方框表示，图4B)。在这两种假设的蛋白质CDS的下游，发现了更多的遗传变异性。蔗糖阴性菌株基因组的四个例子如图4B所示：在菌株CDC-K4557、FORC-006和ATCC 17802中，出现了不同的基因簇，而在菌株CDC_K5579中，只存在两种常见的假设蛋白CDS。在蔗糖阴性菌株的所有基因组中，二氢叶酸还原酶基因和转录调节器的两个基因位于S-谷胱甘肽转移酶基因的上游，如溶藻弧菌ATCC 33878的基因组中所发现的(图4B)。

  总结

  我们描述了副溶血性弧菌菌株中的一个基因组岛，它携带编码蔗糖摄取和降解蛋白质的基因。我们可以通过在副溶血性弧菌和创伤弧菌中克隆和表达来验证三个基因scrA、scrK和scrB的功能。

  具有scr基因组岛的重组pVv3质粒在大肠杆菌K12中也具有功能。针对三个scr基因的多重PCR显示，该基因簇存在于蔗糖阳性副溶血性弧菌菌株中。通过对17个蔗糖阳性副溶血弧菌的WGS，我们可以表明这些基因排列在一个保守的基因组岛上，该岛与溶藻弧菌的scr基因组区密切相关。

  该岛存在于遗传多样的菌株中，并不局限于副溶血性弧菌菌株的一小部分。

  如果检测到蔗糖阳性副溶血性弧菌分离株，食品实验室可以使用针对scrAKB基因的多重PCR检测生化表型。