通过分子对接辅助筛选开发针对副溶血性弧菌的人工溶素

  利用分子对接的方法，将噬菌体溶菌素Lysqdvp001 (Lys)与外膜不稳定肽融合，设计并开发新型的抗副溶血性弧菌溶菌素。选择11种对LPSA有高亲和力的人工合成溶素，其中8种经克隆和表达后显示出对副溶血性弧菌肽聚糖的水解能力。纯化后，最终得到分子量约为30–35 kDa的高度纯化的溶素HPP-Lys，SM29-Lys，EC2-Lys，M78-Lys，M21F-Lys和sTHA-Lys。除HPP-Lys外，这些重组蛋白对副溶血性弧菌具有良好的抗菌活性，其中sTHA-Lys表现出最强的抗菌活性，具有50μg/mL的最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)以及更宽的抗菌谱，还能够抑制细菌生物膜的形成，是一种很有前途的副溶血性弧菌污染抗菌剂。

  一、实验背景

  革兰氏阴性菌因为存在额外的OM，内溶素的应用经常受到阻碍。抗菌肽是一组低分子量蛋白质，对细菌、病毒和真菌具有广谱抗菌活性，通常这些多肽通过非特异性机制作用于微生物细胞的多个靶点，并且由于其与微生物细胞的选择性亲和力，对哺乳动物细胞无毒，且细菌很难对抗菌肽产生高水平的耐药性。应用蛋白质工程对具有OM不稳定能力的多肽(artilysins)进行修饰，可以使溶菌素具有穿越革兰氏阴性细菌OM的能力，从而裂解细菌细胞壁，导致细胞裂解和细菌死亡。artilysins的设计比较复杂，生物信息学分析、计算机模拟和分子对接方法可以预测分子结构，分析分子之间的亲和性和相互作用模式，因此一直被用于新药的虚拟筛选和开发。

  二、实验结果

  1、人工溶素设计

  21种具有潜在OM不稳定能力的肽与副溶血弧菌噬菌体裂解素Lys的N端或C端融合，设计出42种artilysins(图1)。Lys和所设计的artilysins的三级结构通过Robetta服务预测，并通过Ramachandran图、ERRAT和VERIFY3D工具分析，结果显示预测的Lys三级结构和所设计的artilysins具有较高的可接受性。

  2、人工溶素与LPSA和PG的亲和力

  Lys的LPSA结合能估计为−3.7 kcal/mol，与Lys相比，大多数artilysins对LPSA具有更高的结合能，这表明artilysins之间的相互作用可能比内溶素和其他artilysins的相互作用更强(图2)。Lys的PG结合能为−5.8 kcal/mol，而这些artilysins的PG结合能为−5.3 ~−6.3 kcal/mol，表明内溶素和artilysins与细菌PG之间具有相似的亲和力(图3)。

  3、人工溶素活性的初步测定

  将以下8种人工溶素HPP-Lys、MW2-Lys、SM29-Lys、M78-Lys、EC2-Lys、M21F-Lys、sTHA-Lys和Lys-PAR进行克隆表达，均在SDS-PAGE凝胶上呈现单蛋白条带，分子量约为30-35 kDa。使用其处理经EDTA预处理的菌悬液，测量发现OD450 的值显著下降，这一结果表明这些重组蛋白的表达具有水解PG的活性。

  4、人工溶素的抑菌活性

  测定8种溶素的MIC和MBC，并将其与市售抗菌肽ε-PL进行比较，结果表明ε-PL的MIC为800 μg/mL。HPP-Lys对副溶血性弧菌无明显抑制作用。在MIC和MBC浓度为50μg/mL时，sTHA-Lys抗菌活性最强。此外，SM29-Lys、EC2-Lys、M78-Lys和M21F-Lys的mic和MBC分别为100、200、100、50 μg/mL和100、400、100、100 μg/mL(图4)。

  5、sTHA-Lys的理化性质研究

  sTHA-Lys不仅能抑制所有14株副溶血性弧菌，还能抑制其他几种革兰氏阴性菌，而噬菌体qdvp001仅能抑制3株副溶血性弧菌(图5)。研究了sTHA-Lys (25 ~ 100μg/mL)对Tris-HCL缓冲液和牡蛎匀浆中副溶血性弧菌的抑菌效果，sTHA-Lys对副溶血性弧菌的杀灭效果具有剂量依赖性(图6)。此外sTHA-Lys可有效减少副溶血弧菌成熟生物膜，对副溶血性弧菌生物膜的形成具有明显的抑制作用(图7)。

  三、实验结论

  综上所述，本研究以噬菌体内溶素Lys和OM不稳定肽为基础，开发新型人工溶素，得到的8种重组溶素中7种表现出良好的抑菌活性。其中在50 μg/mL MIC和MBC浓度下，sTHA-Lys抗菌活性最强，还显示出更广泛的抗菌谱，能有效灭活缓冲液和牡蛎匀浆中的副溶血弧菌，根除细菌成熟生物膜，抑制细菌生物膜的形成，为设计可替代抗副溶血性弧菌的抗菌药物提供了思路和参考。

  参考文献：Ning Houqi,Zhang Jing,Wang Yinfeng,Lin Hong,Wang Jingxue. Development of highly efficient artilysins against Vibrio parahaemolyticus via virtual screening assisted by molecular docking[J]. Food Control,2023,146.