创伤弧菌中丝氨酸蛋白酶表达的研究

创伤弧菌是一种常见的革兰氏阴性嗜盐性河口细菌，是许多国家海产品相关死亡的主要原因。从患病鳗鱼中分离的创伤弧菌NCIMB2137可产生一种名为VvsA的45-kDa丝氨酸蛋白酶（图 1）。基因vvsA和下游基因vvsB构成操纵子，VvsB充当VvsA的分子伴侣。在副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维弧菌和深部光杆菌中也发现了类似的操纵子。 VvsA与所有同系物具有63-76%的高同源性，而VvsB的同源性为29-56%。此外，丝氨酸蛋白酶已被证明在弧菌科中作为毒力因子参与人类感染期间的特征性皮肤损伤，并可能导致鳗鱼弧菌病的外部和内部出血。

无细胞蛋白质合成系统最近已成为快速、高效和具有成本效益生产的强大技术平台。但因为其对生产者具有强大的毒性，细菌蛋白的表达存在困难。因此，体外蛋白质合成机制是技术上的福音。研究人员尝试使用体外无细胞翻译系统合成丝氨酸蛋白酶的活性形式，用于VvsA的功能表征。

研究人员分别表达vvsA和vvsB基因，并使用RT-PCR检测它们mRNA的表达。然而由vvsA产生的样品没有表现出蛋白酶活性；十二烷基硫酸钠（SDS）分析检测到VvsB蛋白，但未检测到VvsA蛋白；在蛋白质的氨基末端使用组氨酸（His）标签抗体进行的蛋白质印迹分析也显示vvsA没有产生蛋白质，仅检测到阳性对照GFP和VvsB的表达。这些结果表明了vvsA的翻译，而非转录。

分析RTS中VvsA生产失败的原因：研究人员认为VvsB在VvsA的合成过程中起着分子伴侣的作用，但由于VvsA和VvsB在RTS中分别表达，因此两者不相关联，且与细胞膜没有相互作用，故不利于VvsA活性形式的构建。

由于上述方案均未导致使用RTS产生活性形式的VvsA，因此研究人员采用了使用细菌系统表达蛋白质的常规方法：在pBluescript IIKS+载体中克隆了vvsA和vvsAB操纵子，并将其转化为大肠杆菌HB101。SDS-PAGE分析结果表明，含有vvsA和vvsB的丝氨酸蛋白酶基因的操纵子在大肠杆菌中表达，虽然产生了丝氨酸蛋白酶，但它们在不同的位点被切割，没有检测到活跃的成熟形式。vvsA的表达是创伤弧菌的特征性事件，在其他细菌中不会发生。

参考文献：

Kawase T, Debnath A, Mizuno T, Miyake Y. Investigation of the Expression of Serine Protease in Vibrio vulnificus. Biol Pharm Bull. 2022;45(11):1596-1601. doi: 10.1248/bpb.b22-00106. PMID: 36328494.