背景

诺如病毒（Norovirus）是引起急性胃肠炎的主要病原体之一，其中GII.4基因型因其高传染性和流行性而备受关注。传统的病毒检测方法在灵敏度和特异性方面存在局限，特别是在质量控制和标准化检测中，缺乏稳定的参考材料。因此，开发诺如病毒GII.4假病毒作为质控品，不仅能提高检测方法的可靠性和一致性，还可为病毒学研究和诊断提供重要工具。

研究方法

本研究通过构建诺如病毒GII.4基因型的假病毒，开发了一种用于质量控制的参考材料。首先，研究团队设计并合成了针对GII.4基因型的特异性引物和探针，用于逆转录数字 PCR （RT-dPCR）检测。随后，通过基因工程技术将诺如病毒GII.4的关键基因片段插入到非感染性载体中，构建假病毒，并对其进行体外转录和包装以模拟真实病毒的核酸特性。最后，通过一系列验证实验，包括灵敏度、特异性、稳定性和重复性测试，评估假病毒作为参考物质（RM）的适用性。 
RT-dPCR 方法的建立及其灵敏度

通过不同退火温度和引物及探针的浓度探索，发现54°C是最佳退火温度，PCR系统中引物和探针的浓度经过优化，分别测定为 500 nM 和 200 nM。并证实所建立的方法具有良好的线性，且该方法的LOD和定量限LOQ确定为 5 拷贝/μL，具有极高灵敏度。如图1所示。 

                                                               图 1 .RT-dPCR 方法的测量范围。源自参考文献

均匀性和稳定性测试

作者根据 ISO 33405：2024使用F检验评估 NV GII..4 RM 的均匀性，结果表示 NV GII..4 RM 表现出均匀性，假病毒在-80°C条件下储存6个月后，核酸含量和检测信号无显著下降，表现出良好的长期稳定性。为了模拟实际状况，通过在 -20 °C、4 °C 和 25 °C 下储存 1 、 3 和 7 天评估短期稳定性，分析显示，RM 在低于 4 °C 的温度下保持稳定长达 14 天。如图2所示。

                                                           图 2 RM 短期稳定性评估源自参考文献 

商业试剂盒和 dPCR 平台的验证

使用成熟的 RT-dPCR 方法，NV GII..4 RM 在四种不同的 dPCR 平台（平台 A/B/C/D）上成功进行了鉴定，值得注意的是，尽管它们的基本机制不同，但所有四个平台都产生了没有明显区别的量化结果（图3）。这清楚地证明了 RM 值在这些选定的商业 dPCR 平台上的可重复性。 
图 3 通过四种试剂盒的dPCR平台验证 RM。值源自参考文献

结论

本研究开发的GII.4诺如病毒质控品为病毒检测提供了可靠的标准化工具，具有良好的灵敏度、特异性和稳定性。未来可进一步优化伪病毒的生产工艺并扩展其在其他检测平台中的应用，以推动诺如病毒诊断技术的发展。

参考文献：Establishment of pseudovirus reference material for human norovirus GII.4