iMeta | 周哲敏/张嵘/何平-解析肺炎克雷伯菌CC23的地理局限性和毒力-耐药性权衡

地理局限性和毒力-耐药性权衡驱动高毒力肺炎克雷伯菌的进化

 

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研究论文

原文: iMeta (IF 33.2, 中科院双一区Top)

原文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/imt2.70077

DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.70077

2025年9月4日，苏州大学周哲敏、浙江大学第二附属医院张嵘和上海交通大学医学院何平等在iMeta在线发表了题为“Geographic containment and virulence-resistance trade-offs drive the evolution of hypervirulent Klebsiella pneumoniae”的文章。

本研究使用全球62个国家的2563个肺炎克雷伯菌CC23基因组数据，通过生物信息学分析和实验验证，揭示了这一潜在大流行谱系进化中的毒力-耐药性权衡现象，阐明了地理差异引发的适应性选择及其对暴发模式的差异影响，并从进化角度限制高毒力高耐药细菌的传播提供了重要参考。

第一作者：吴雨辰、普帆

通讯作者：周哲敏（zmzhou@suda.edu.cn）、张嵘（zhang-rong@zju.edu.cn）、何平（hpatsh@sjtu.edu.cn）

合作作者：严泽琳、张燕燕、陈开超、李晟恺、王越卓、伦赫远、屈婷婷、汪晶、李恒、顾丹霞、陈声

主要单位：浙江大学第二附属医院、苏州大学、上海交通大学医学院、中国疾病预防控制中心

 亮 点

CC23-K1 型高毒力肺炎克雷伯菌在全球范围内表现出显著的地域分区特征，其传播模式受地理距离驱动；

碳青霉烯耐药性表现出显著的不稳定性，存在超过130次的获得事件以及频繁的丧失；

高效碳青霉烯酶（KPC/NDM）在亚洲流行，但与高毒力性状不相容；而欧洲流行的低效OXA-48则更易保留毒力决定因子。

 摘 要

高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（hvCRKP）的出现，标志着强毒力和泛耐药性的融合，引发了公众严重担忧。本研究对来自62个国家、时间跨度从1932年至2024年的2563株肺炎克雷伯菌克隆复合体23（CC23）分离株进行了全面的基因组分析。结果显示，CC23-K1这一主要的高毒力亚谱系约于170年前出现，并分化为七个主要分支，各分支表现出明显的区域优势。我们观察到CC23-K1中的碳青霉烯耐药性高度不稳定，至少发生130次独立获得事件和20次耐药基因丢失，提示高毒力和耐药性之间存在进化权衡。实验表明，荚膜的存在在物理层面阻碍质粒接合；同时，携带blaKPC-2、blaNDM-1或blaNDM-5的分离株常伴随关键毒力决定因子的缺失。相反，携带blaOXA-48的分离株多能维持毒力基因的完整性，这可能归因于其较低的水解活性及较小的适应成本有关。耐药机制的地理分布与区域抗菌药物使用模式相关：欧洲（碳青霉烯使用适中）以OXA-48酶为主，而亚洲（使用量较高）则偏向于与完整毒力因子不兼容的高效碳青霉烯酶（KPC/NDM）。我们还在耐药分离株中识别到核心基因组突变率显著升高的区域，尤其影响氧化磷酸化与活性氧产生相关通路。上述发现为 CC23 的进化与地理传播提供了新的见解，并补充了现有关于肺炎克雷伯菌谱系中碳青霉烯酶分布模式的知识。

引  言

肺炎克雷伯菌是医疗机构和社区相关感染的主要病原体，可引发从肺炎到危及生命的血流感染等多种疾病。该细菌展现出显著的遗传多样性，多重耐药株（MDR-KP）常与医院获得性感染相关，而高毒力株（hvKP）传统上多见于社区获得性感染，耐药性较低。然而，高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（hvCRKP）的出现引发了广泛关注。在这些菌株中，克隆复合体（CC）23，包括序列型（ST）23及其单基因座变异体，已在欧洲成为重点关注对象，引发了对肺炎克雷伯菌流行病学潜在变化的质疑。目前，相较其他CRKP谱系，其临床意义仍待进一步确立。

CC23菌株，特别是K1荚膜血清型的菌株，因携带关键毒力决定因子而被视为高毒力株，包括粘液表型调节基因（rmpA/rmpA2）、三种铁获取系统基因（iucABCD-iutA、iroBCDN和耶尔森菌高致病性岛（HPI））以及大肠菌素基因毒素（clbA-S）。近年此类传统高毒力菌株与多重耐药性（尤其碳青霉烯耐药）关联日益增加，尤其在欧洲。多个CC23 hvCRKP分离株集群与爱尔兰、拉脱维亚和法国医疗机构的相关暴发有关，提示潜在的局部传播趋势和国内扩散风险。理解这些菌株中毒力和耐药性之间的相互作用，可为其他新兴高风险克隆的防控提供启示。

尽管先前研究已描述CC23菌株的群体结构和进化历史，但高毒力背景下获得并维持碳青霉烯耐药性的具体机制仍存疑问。一些报告显示，hvKP菌株获得碳青霉烯耐药性不会显著削弱其毒力，但其他研究指出两者可能存在不相容性。在单一菌株中同时维持高毒力和耐药性会带来进化挑战，阐明这些特征间的遗传和表型交互作用，有助于制定监测和控制策略。

本研究对来自50个国家、跨越90年的ST23国际分离株开展综合分析。我们整合基因组流行病学与实验验证，探究CC23-K1的群体结构、进化动力学与地理分布，解析碳青霉烯耐药获得模式，并检验高毒力与特定碳青霉烯酶类型之间的潜在权衡，该结论对不同遗传背景的hvCRKP具有普适意义。

结  果

肺炎克雷伯菌CC23的全球群体结构和地理分布

我们在浙江杭州一家教学医院对肺炎克雷伯菌进行了30年的纵向监测，结果显示CC23占碳青霉烯敏感分离株的9.5%，而占碳青霉烯耐药分离株的比例不足1%（图S1）。例外的是2006-2008年间，CC23 CRKP分离株比例峰值达15%，比其他地区的首次分离报告早三年。记录的CC23感染中无死亡病例。我们对来自中国六个省份的151株CC23分离株（1999-2024）进行了测序，并整合公开数据，形成覆盖62个国家、时间跨度1932-2024年的2563株分离株综合数据集（图1A）。

系统发育分析表明CC23呈多系分布，包含至少40个ST（表S1），散布于22个不同分支中（图S2和表S2）。值得注意的是，多个 ST（包括 ST23）出现在不同分支，提示频繁重组。使用cgLINcode的核心基因组基础命名进一步确认了至少13个不同亚谱系和27个基因组克隆组的存在。大多数分离株（2220/2563，86.6%）聚集到单一分支（CC23-K1），以其K1荚膜型命名，该型与高毒力相关。然而，cgLINcode及其他基于cgMLST的方法在分辨CC23-K1内世纪尺度亚谱系时分辨率不足，这是基于距离的等位基因方案的固有限制。相比之下，全基因组 SNP 的系统发育方法可捕获解决历史分支事件所需的精细突变信号。

在去除重组区域后，对CC23-K1谱系的分析确定了93.6%分离株（2077/2220）中的七个主要分支（A-G）（图1B，S3A），呈显著地理分区：分支C主要在东亚，分支部D在东南亚，分支B和E在欧洲（Fisher精确检验，所有p < 1e-8；图1C）。

我们在CC23-K1内识别出339株产碳青霉烯酶的分离株，主要携带blaKPC-2（129株，38%）、blaOXA-48（94株，28%）、blaNDM-1（37株，11%）和blaNDM-5（29株，9%）（表S3）。这些产碳青霉烯酶的分离株约占2013年以来CC23-K1分离株的20%（图1A）。碳青霉烯酶分布显示出明显的区域特异性：blaKPC-2在中国、新加坡和美国占主导，而blaOXA-48和blaNDM-5分别在欧洲和孟加拉国最常见（图S3B）。

 

图1. 肺炎克雷伯菌克隆复合体23（CC23）K1谱系的全球分布与进化动态

（A）从1932年至2024年K. pneumoniae CC23分离株的时间分布，显示了基因组数量（柱状图），按其预测的抗菌药物耐药谱分层。黑线表示随时间变化的碳青霉烯酶编码菌株在所有CC23中的百分比。ESBL：超广谱β-内酰胺酶。（B）去除重组区域的CC23-K1谱系（n = 2077）的最大似然系统进化树，揭示了七个不同的进化枝（Clades A-G），以不同颜色显示。外圈显示关键元数据分布，包括毒力因子、抗生素耐药性（ESBL和碳青霉烯酶基因）、分离国家以及进化枝归属。标记的分支（B1-G1）表示主要碳青霉烯酶耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）簇，按碳青霉烯酶类型（括号内）定义。K/O_status：与荚膜（K）或O抗原合成相关的基因是否完整，或部分/完全缺失。（C）CC23-K1进化枝的全球地理分布。饼图表示每个地理区域中不同进化枝的相对丰度，大小与分离株数量成比例，如图例所示。

碳青霉烯耐药性的重复获得和丢失

CC23-K1谱系至少独立获得碳青霉烯酶基因130次，在系统发育中形成不同的集群（图1B）。仅15个集群包含三个或更多CRKP分离株，我们将其指定为CRKP集群B1-G1。CRKP的成对比较显示，同一集群内94%的菌株差异少于93个单核苷酸多态性（SNP）（图S4A），强调了它们的近期出现。

使用相同SNP阈值对所有CC23-K1菌株的网络分析产生了254个不同的模块（图S4B）。值得注意的是，38个CRKP相关大模块（≥3个分离株）中的36个（95%）也包括碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）（图S4C）。CRKP和CSKP之间的混合表明存在频繁的基因获得和丢失循环，可能由双向选择压力驱动。

群体动态和距离驱动的传播

CC23-K1谱系的TreeTime分析估计其起源约在1857年（95% CI: 1843-1875）（图2A），通过随机化测试验证了显著的时间信号（图S5A-C）。使用CC23-K1菌株的四个随机子集的独立BEAST2运行同样估计CC23-K1的起源在1834年至1888年之间（图S5D-H）。所有进化分析都表明有效群体大小在1940年代显著扩张，与国际传播加速同时发生（图2B）。

直接祖先状态重建表明中国是国际传播的主要来源，贡献了55%（92/167）的传播事件（图S6A）。为减轻欧洲与东亚地区的采样不均衡，我们实施随机下采样策略，在系统地理重建分析中每国最多保留10株（见方法）。使用这些平衡数据集（100个重复子样本）的系统地理重建确认了总体传播趋势，中国仍然是主要的传播来源（22.2%的传播），其次是比利时（18.5%）和印度（12.2%）（图S6B-F）。网络分析揭示了八个具有强地理特异性的国家模块（图2C）。我们观察到传播频率与国家间地理距离之间存在显著负相关（R2 = 0.73）（图2D和表S4），距离 < 500公里的国家之间的传播频率约为距离>3000公里的国家的五倍（0.16 vs 0.03），突出了地理屏障在CC23-K1传播中的作用。

 

图2. 炎克雷伯菌CC23-K1谱系的进化动态与地理传播模式

（A）使用TreeTime构建的CC23-K1谱系的时间校准系统进化树，分支按来源国家着色，如图例所示。七个主要进化枝（Clades A-G）在树右侧标示。请注意，(a)与(b)部分共享相同的时间轴（年份），以便直接比较系统进化分歧与种群扩张动态。（B）CC23-K1的有效种群大小动态，以对数尺度显示。黑线表示中位估计值，灰色阴影区域表示95%置信区间。（C）CC23-K1谱系的国际传播网络。节点代表国家，节点大小与分离株数量成比例。连接节点的边表示传播事件，其大小与来源国家对目标国家的相对贡献频率成比例。国家被聚类为不同的模块，以不同颜色表示，揭示了传播模式的地理特异性。模块使用Louvain算法估计。（D）国家间传播频率与地理距离的相关性，以对数-对数尺度显示。国家距离估计为两国主要城市之间的最小距离，从https://www.geonames.org获取。国家对按其对数变换距离每0.1进行分箱，圆圈大小与相关对的数量成比例。观察到显著负相关（R²=0.73），表明传播频率随地理距离增加而减少。

携带碳青霉烯酶质粒的地理特异性

我们在CC23-K1分离株中识别出28个不同的碳青霉烯耐药质粒，根据Li等人的质粒分型（PT）方案，每种都与特定的碳青霉烯酶基因密切相关。最流行的是PT_804（93株分离株，blaOXA-48）、PT_360（45株，blaKPC-2）、PT_3142（36株，blaKPC-2）和PT_695（26株，blaNDM-5）。

Theil's U检验表明质粒分布与宿主细菌分支仅呈弱相关（U = 0.206）（图3A），提示即使在不同克隆复合体或物种之间也存在频繁的水平转移（表S5）。例如，PT_3142在88个不同的序列型和11个其他肠杆菌科物种中被检测到，包括肠炎沙门菌和福氏志贺菌。

相比之下，地理起源对质粒分布变异的解释力更强（Theil's U = 0.366；图3A），八种质粒主要（≥80%的分离株）在单个国家检测到，另外四种显示大洲特异性。系统发育分析强化了这些地理模式：来自新加坡的PT_3142质粒，由来自五个不同分支的菌株携带，显示出无法区分的核心基因组序列（图S7A）。同样，来自欧洲各国的PT_804质粒形成了与中国分离株不同的紧密系统发育集群（图S7B）。这些地理模式，加上碳青霉烯酶基因和质粒之间的强关联（图3B），部分解释了碳青霉烯酶基因的区域分布，并突出了质粒在维持抗菌药物耐药性中的作用。

 

图3. 肺炎克雷伯菌CC23-K1中携带碳青霉烯酶的质粒的地理分布与遗传关联

（A）携带碳青霉烯酶的质粒在不同细菌谱系（左）和国家（右）中的分布。x轴表示分离株数量。每种质粒类型（PT）标注了总分离株数量（括号内）。左图颜色代表不同CC23-K1进化枝，右图颜色代表不同国家。主要大陆关联被标注（欧洲、亚洲、美洲），显示某些质粒的强烈区域特异性。（B）桑基图示意质粒类型（左）与碳青霉烯酶基因（右）之间的关系。每条流的宽度对应特定质粒类型与碳青霉烯酶基因关联的频率。

毒力和抗菌药物耐药性之间的权衡

我们的分析揭示了CC23-K1菌株中毒力和抗菌药物耐药性之间的显著负相关。单因子分析表明，编码blaNDM或blaKPC基因的菌株在编码荚膜合成（cps）、O抗原合成（ops）、铁载体（iro）和粘液表型调节剂（rmp）的区域表现出显著的遗传减少（Fisher精确检验p < 0.01；图S8A-H）。结合基因破坏和缺失，我们发现超过60%携带blaKPC-2（p < 0.001）、blaNDM-1（p < 0.001）、blaNDM-5（p < 0.001）或多种碳青霉烯酶基因（p < 0.05）的分离株存在关键毒力基因的部分或完全缺失。相比之下，携带blaOXA-48-like、blaIMP-26或blaVIM-1基因的分离株能维持与CSKP相当的毒力基因完整性（图4A）。为控制潜在偏倚，我们按地理起源、项目和分离来源对所有CC23-K1分离株进行分层，在各种亚群中一致观察到毒力基因与blaNDM/blaKPC基因之间的负相关关系（p < 0.05）（表S6）。

我们进一步采用所有毒力因子的祖先状态重建分析来最小化采样偏倚。这种系统发育方法确认了cps、ops、iro和rmp基因的存在与blaKPC或blaNDM基因的获得呈负相关（所有p < 0.01；表S7和S8）。此外，我们的进化分析表明毒力基因减少可能先于碳青霉烯酶基因获得。例如，在缺乏O抗原的祖先节点中，耐药基因获得的频率从2.31%增加到6.33%（2.7倍增加）（表S7），这超过了ST23 CRKP中O抗原缺失频率的增加（从7.98%到14.02%，1.8倍增加）（表S8）。这些模式可能由毒力-耐药的直接权衡所致，亦可能源于临床环境下对不同选择压力的平行适应。

为避免暴发簇的影响，我们将CRKP聚集（≥3株）与单例分离分析。即便排除聚集内菌株，我们仍然观察到携带blaKPC-2（p < 0.001）、blaNDM-1（p < 0.001）或多种碳青霉烯酶基因（p < 0.05）的分离株仍显示更低的毒力基因完整性（图4B）。

CRKP 集群（指来自多名患者、在基因组上彼此相关的分离株）较单例分离株更可能代表具有持续传播能力的成功谱系。基于自然选择塑造“毒力-耐药”权衡的假设，我们预计该权衡在 CRKP 集群中会更为显著。我们的分析证实了这一预测，CRKP集群中出现更广泛的毒力基因缺失，特别是那些携带blaKPC-2和blaNDM-5的菌株（所有p < 0.05；图S8I）。七个CRKP集群完全缺乏具有完整毒力基因集的分离株，另外四个集群表现出显著的毒力基因缺失（图4C）。与blaOXA相关的CRKP多能维持毒力基因，可能由于其对碳青霉烯与头孢菌素活性较低，从而降低了同时维持耐药-毒力机制的进化成本（图 4D）。

 

图4. 肺炎克雷伯菌中毒力与抗菌药物耐药性的权衡

（A）不同碳青霉烯酶产生肺炎克雷伯菌分离株中毒力基因完整性模式（rmpA/iro/cps/ops）的分布。x轴显示碳青霉烯酶类型；y轴显示具有每种完整性模式（I=完整，D=缺失/破坏）的分离株百分比。最右侧直方图显示碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（CSKP）分离株，用于与CRKP的Fisher精确检验比较。每种碳青霉烯酶类型的相关分离株数量显示在直方图上方。星号表示统计显著性：*p < 0.05，***p < 0.001。Multi：具有多个碳青霉烯酶基因的分离株。（B）(A)的重复，但移除了所有CRKP簇中的分离株，以缓解潜在采样偏差。（C）不同CRKP簇中的毒力基因完整性模式。最右侧直方图显示这些簇以外的所有分离株，包括CSKP和CRKP单体。每种碳青霉烯酶类型的相关分离株数量显示在直方图上方。星号表示统计显著性：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。（D）不同碳青霉烯酶对β-内酰胺类抗生素的水解效率（kcat/KM值），以对数尺度呈现。数据来源于http://www.bldb.eu/F-BLDB.php。（E）高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）分离株（n=14,600）中毒力基因的流行度比较，非CC23谱系，包括hvCSKP（3483分离株）和hvCRKP（11,117分离株）。hvKp分离株基于Kleborate的毒力分数≥3定义，表示iuc位点的存在。然而，其中一些iuc位点仍被指定为缺失，由于突变或短插入/缺失导致的编码序列破坏。（F）具有完整和突变毒力基因的菌株在小鼠感染模型中的体内毒力比较。具有破坏性毒力因子的菌株显示出显著降低的致死性，而完全毒力菌株为100%死亡率，在相同感染条件下（***p < 0.001）。（G）具有缺失cps、wzi和rmp基因的分离株的荚膜产生减少。具有缺失wzi或rmp基因的菌株显示荚膜厚度降低，而缺失cps基因的菌株不产生荚膜（*p < 0.05）。（H）KL1型肺炎克雷伯菌菌株有或无荚膜的接合频率。野生型（WT）菌株6113、WT菌株6113处理以K1荚膜多糖解聚酶（6113 + Dep）以及wcaJ基因敲除6113菌株（6113 ΔCPS）的接合频率。供体菌株为大肠杆菌C600（携带blaNDM-1）。数据以log10百分比接合频率表示（均值±SD）。(**p < 0.01)。

肺炎克雷伯菌中毒力-耐药权衡的普遍存在

在80,300个公开可获得的肺炎克雷伯菌基因组中识别出14,600个非CC23 hvKP（Kleborate的毒力评分≥3，主要来自ST11（4699）、ST147（1203）和ST15（580））。其中76%（n = 11,117）也编码碳青霉烯酶（hvCRKP）。大多数hvKP编码iuc（98%）、ybt（77%）和rmpA2（71%）（图4E和表S9）。值得注意的是，rmp、iro、clb 在 hvCSKP 中的检出率分别为 45%、58%、15%，但在 hvCRKP 中仅为24%、5%、2%（均 p < 1×10-6），与 CC23-K1 的模式一致。ST11 L1（ST11的中国分支，由荚膜型K47和K64定义，引起中国大多数医院获得性感染）菌株中也显示出这些基因的低流行（分别为35%、5%和0.3%；图S8J, K）。

毒力-耐药权衡的实验验证

小鼠体内实验证实，关键毒力因子完整性与致死性高度相关，特别是我们上面预测的在耐药菌株中经常缺失的K抗原、iro和rmp。任何上述基因缺失均显著削弱体内毒力，即使在高接种量水平（5 × 10⁵ CFU）下也无法在14天内诱导小鼠死亡（图4F，S9）。而毒力完整的 CC23-K1 菌株在相同条件下致死率达100%。

在荚膜表型上，wcaJ（初始糖基转移酶）缺失可完全消除荚膜产生（图4G）。rmpA的缺失使荚膜产量约减半（20 μg/OD vs. 40 μg/OD）并显著降低体内毒力。wzi 缺失显著减少表面附着的荚膜（约 6 μg/OD），但对毒力影响较小，提示“荚膜量-毒力”并非线性对应。

此外，我们观察到高水平的荚膜产量物理阻碍质粒转移。在ST23菌株6113中，wcaJ 缺失使blaNDM-1 质粒的接合频率提高约10倍（图4H）。经K1多糖解聚酶处理亦提高约4倍，证明了荚膜的物理屏障效应。这些发现为“高毒力-低耐药获取能力”提供了机制基础。

基因组多样性和选择模式

在排除重组事件后，我们在CC23-K1的4.9 Mb核心基因组中观察到144,153个突变，导致每个位点平均突变频率为0.029。值得注意的是，基因间区（约占核心基因组10%）的突变贡献达20%，显著高于编码区（图 5A）。

经 Bonferroni校正的Fisher检验鉴定226个基因间区域和31个基因为高突变区域（HMRs）（p < 0.01）（图5B，C和表S10）。这种基因间HMRs的富集似乎是CC23-K1特有的，因为对肺炎克雷伯菌ST11谱系的类似分析显示高突变基因和基因间区域的数量相似（73 vs 88，图S10A和表S11）。

HMRs周边基因功能富集于肌醇代谢与磷酸转移酶系统（PTS），涉及碳源摄取、糖酵解及三羧酸循环（TCA）前体（图S10B，C），包括iolCDE、ptsG、ascF、treB、celAB等，已知与cAMP依赖的持续性与毒力调控相关。

单因素方差分析证实约半数HMR呈显著地理变异（113/257），部分在特定国家突变富集：肌醇代谢相关4个区域有3个在印度优先突变；PTS中12个区域有半数在亚洲国家优先突变，提示对当地生态条件的代谢适应（图 5D）。

 

图5. 肺炎克雷伯菌CC23-K1的基因组多样性、选择模式以及毒力-耐药性权衡模型

（A）CC23-K1核心基因组中基因间区（橙色）和编码基因（蓝色）突变率的比较。基因间区显示显著更高的突变率（每位点0.055单核苷酸多态性（SNPs）），相比编码区（0.026）（p < 0.001）。（B）火山图显示通过Fisher精确检验与Bonferroni校正（p < 0.01）鉴定的高突变区域（HMRs）。橙色点代表基因间区（226多样化，307其他），蓝色点代表基因（31多样化，4573其他）。x=4的虚线表示突变率增加4倍。（C）SNPs在CC23-K1染色体和毒力质粒PT_499上的分布。橙色条代表基因间突变，蓝色条代表编码区突变。（D）桑基图显示具有显著国家特异性模式的高突变区域突变的地理分布。基因功能类别在左侧，国家在右侧。两个富集通路标记为‘*’，印度肌醇代谢基因和亚洲国家磷酸转移酶系统中的优先突变，通过方差分析（ANOVA）测试与Bonferroni校正（p < 0.01）。（E）三个独立比较中每基因SNP频率差异的比较分析：携带(A) blaKPC/blaNDM vs. (B)其他碳青霉烯酶的分离株（上）；(A) ESBL阳性 vs. (B) ESBL阴性分离株（中）；以及具有(A)不完整 vs. (B)完整毒力基因的分离株（下）。三个基因组区域（r1、r2、r3）在所有三个比较中一致显示显著差异SNP模式（Tukey的诚实显著差异（HSD）事后检验，p < 0.01）。（F）携带blaKPC/blaNDM分离株中优先突变基因的功能富集。（G）与四个富集通路相关的拟议代谢通路。磷酸转移酶系统（PTS）和肌醇代谢中的突变可能减少中心代谢流，而醌合成和氧化磷酸化中的突变可能减少电子传递链（ETC）流，二者均导致活性氧（ROS）和泛耐受性的减少。（H）肺炎克雷伯菌CC23-K1中解释毒力-耐药性权衡的拟议平衡模型。该模型阐释了不同碳青霉烯酶基因（低效率的blaOXA-48-like vs. 高效率的blaKPC/blaNDM）如何影响毒力-耐药性平衡，导致hvCRKP流行度的区域差异以及相关爆发风险。

毒力-耐药权衡在核心基因组中的影响

方差分析确定了三个核心基因组区域，在携带blaKPC和blaNDM变异的CRKP中与携带其他碳青霉烯酶基因的菌株相比具有更高的突变率（图5E）。相同的区域，指定为耐药相关区域（RARs），也区分 ESBL 阳性/阴性与毒力基因完整/受损的菌株（图 5E），提示其在耐药进化中的关键性。

这三个区域的功能分析揭示了与氧化磷酸化和甲萘醌生物合成相关基因的富集（图5H），特别是负责NADH：醌氧化还原酶（复合物I）活性的nuoABCEF基因，和负责甲萘醌生物合成的menBCDEFH基因（图S10D）。这两个途径都参与电子传递链（ETC），驱动三磷酸腺苷（ATP）的合成并产生活性氧（ROS）作为副产物。

总的来说，四个富集的途径（肌醇代谢、PTS、氧化磷酸化和甲萘醌生物合成）都与中心代谢过程相关。遗传变异可能改变了它们的功能并减少了ETC通量，导致较低的ROS水平和对各种压力的更好耐受性（图5G）。

毒力-耐药平衡模型

毒力-耐药权衡表现出明显的区域模式，表明当地生态和流行病学因素塑造了碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的进化动态（图5F）。在几个欧洲地区，blaOXA-48型碳青霉烯酶的主导地位可能与允许保留毒力决定因子的基因组背景相关，可能促进高毒力CRKP（hvCRKP）的出现。相比之下，在许多亚洲地区流行的CRKP菌株更频繁地携带高效碳青霉烯酶，如blaKPC或blaNDM，这些通常伴随着毒力基因的丢失。

讨  论

高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（hvCRKP）的全球出现对公共卫生构成了严重威胁。我们对CC23-K1谱系的综合分析，涵盖基因组、地理和实验方法，揭示了对基因组可塑性、区域隔离和高毒力-耐药性权衡的基本见解，这些因素已经显著影响了这个高风险克隆的进化动态。

与ST258/ST11等通过快速克隆扩张取得全球优势的多耐药克隆不同，CC23-K1虽广泛分布，却呈显著地理分区，传播频率与距离呈强负相关（图1C；图2D），提示地理屏障与局部选择压力在其传播中占主导。

分子定年将CC23-K1的起源定在19世纪中叶，1940年代群体快速扩张与第二次世界大战后的全球化同时发生。这种历史背景与其他成功的全球病原体的类似扩张模式一致。

一个关键发现是CC23-K1中碳青霉烯耐药性的瞬时性质。尽管至少获得了130次碳青霉烯酶基因（图1B），耐药性却很少长期稳定，95%的碳青霉烯耐药集群在狭窄的遗传距离内与敏感菌株共存（图S4B）。这种不稳定性与ST11等谱系形成鲜明对比，后者的碳青霉烯耐药性保持稳定数十年。这种不稳定性可能反映了相互对立的选择力量：在非选择压力环境中，碳青霉烯酶质粒的适应性代价难以为高毒力菌株所承受；而在高抗生素暴露环境中，质粒得以维持，类似于在大肠杆菌ST131中的观察。

地理特异性进一步塑造了耐药模式，特定碳青霉烯酶的区域流行反映了当地质粒生态学（图3A，B）和选择压力。碳青霉烯酶及其宿主质粒的这种地理关联与先前在更广泛的肺炎克雷伯菌群体和其他病原体中记录的模式一致。水平转移似乎主导质粒传播，正如细菌遗传背景对质粒分布的最小贡献所示。

最重要的发现是高毒力和碳青霉烯耐药性之间的潜在权衡。我们在CC23-K1（乃至更广泛hvKP）中观察到“高毒力—高效耐药”难以兼容：blaKPC-2/blaNDM关联毒力基因丢失，而blaOXA-48/blaVIM则更易维持高毒力（图4A、4E）。实验显示，荚膜物理抑制接合（图4H），为该权衡提供了机制依据；这一现象与既往关于荚膜与水平基因转移负相关及噬菌体选择的研究相呼应。

CC23-K1的基因间突变富集（相对ST11特异）提示其更倚重“调控层面”进化以维持代谢灵活性。肌醇代谢、PTS、氧化磷酸化与甲萘醌生物合成通路的变异，构成从碳源摄取至ETC的代谢级联，影响ROS生成与广谱耐受。部分位于代谢-调控级联上游环节的高突变区域，可能以“瞬时突变—环境筛选—区域固定”的方式在亚洲群体中固定，从而重塑CC23-K1的进化轨迹。此外，上述突变途径还参与能量代谢之外的额外生物过程。例如，肌醇代谢已与革兰氏阴性细菌的应激反应和渗透适应相关，可能增强在频繁消毒剂暴露的医疗环境中的生存。同样，PTS成分已与肺炎克雷伯菌的生物膜形成和毒力基因表达控制相关，提示这些突变赋予的多方面优势。虽然我们的比较基因组数据表明电子传递链相关途径的突变可能与减少ROS产生和增强应激耐受性相关，但在缺乏直接功能验证（例如，ROS定量分析）的情况下，这仍然是一个假设，在得出明确结论之前需要进一步的实验工作。

地区抗菌药物使用格局可能塑造“毒力-耐药”平衡：碳青霉烯使用强度适中的欧洲国家（约2.6 DID，占总抗菌药物使用的13%）更常见以OXA-48为主的CRKP，且更易保留关键毒力因子；相较之下，使用强度较高的亚洲国家（约4–6 DID，占20–30%）则倾向于KPC/NDM主导的CRKP，且难与完整高毒力决定因子兼容，从而塑造出不同的hvCRKP进化路径（图5H）。

本研究仍存在局限性。回顾性采样在非洲和南美洲等地区代表性不足，可能偏倚传播推断并掩盖罕见但流行病学意义重大的事件，如跨大陆传播或替代质粒谱系。例如，最近来自智利的一项研究描述了携带双碳青霉烯酶质粒的碳青霉烯耐药高毒力ST23肺炎克雷伯菌菌株的出现，该质粒在高毒力背景下具有高传播性，突出了扩大全球南方监测工作的迫切需要。代表性不足地区的长期监测对于完善CC23-K1全球传播模型至关重要。此外，尽管体内实验与基因组相关性支持“碳青霉烯酶获得-毒力基因丢失”的联系，但尚缺直接因果机制的严格验证。使用的临床分离株在耐药或毒力基因座上不是同源的，背景基因组差异可能混淆观察到的权衡。未来需利用同源菌株对与受控质粒转移体系，解析质粒与染色体对毒力衰减的相对贡献。

结  论

CC23-K1的进化成功取决于平衡基因组可塑性、地理适应和毒力与耐药性之间的有趣权衡。与不同于依赖遗传稳定性的“全球型”大流行克隆，CC23-K1借助“突变敏捷性 + 瞬时基因获得”实现生态位特异适应，却也因此受限于全球扩张。这一“局部适应-全球受限”的悖论，为防控提供了挑战与机遇。未来的监测管线可结合机器学习/深度学习，提升高风险克隆识别、耐药预测与隐匿流行路径发现的能力。通过将监测与干预策略对准区域耐药模式，并在治疗上利用“耐药-毒力”权衡理论，有望降低这一高风险病原体的威胁。

方  法

样本收集和基因组测序

我们从中国六个省份收集了151株肺炎克雷伯菌CC23分离株，时间跨度为1999年至2024年。这些分离株来自多个医疗机构的临床样本，包括浙江杭州的一家教学医院，我们在那里进行了30年的纵向监测。使用标准微生物学方法鉴定临床分离株为肺炎克雷伯菌，包括MALDI-TOF质谱法和生化检测。

根据制造商说明，使用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取基因组DNA。使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，美国）进行文库制备，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行全基因组测序，采用250-bp双端读取。

基因组组装和注释

使用Trimmomatic v0.40对原始测序读取进行质量过滤，以去除接头序列和低质量碱基（质量分数 < 20）。使用SPAdes v3.15.0以默认参数进行de novo组装。使用Prokka v1.14.5对组装的基因组进行注释。所有新测序的基因组已存储在https://github.com/puff0916/ST23_kle。

为了创建一个全面的数据集，我们将我们的151个测序基因组与从NCBI GenBank获得的2412个公开可获得的肺炎克雷伯菌CC23基因组相结合，总共得到来自62个国家的2,563个基因组，时间跨度从1932年到2024年。公开可获得的基因组被下载并使用与我们测序分离株相同的组装和注释流程进行处理，以确保一致性。我们的组装和公共数据库的组装质量都使用Kleborate v3.1.3进行评估，仅保留N50≥10Kb且总大小在5至6.5 MB之间的组装。使用托管在https://pathogen.watch/的cgLINcode方案预测CC23基因组的亚系和克隆群。

碳青霉烯耐药基因和质粒的识别

耐药基因、毒力基因和巴斯德研究所7位点MLST STs均使用Kleborate v3.1.3进行预测。使用KleTy预测和基因分型质粒，该工具基于基因内容和序列相似性识别质粒复制子并表征质粒类型。使用核心基因组比对和最大似然法构建质粒系统发育树，如上所述。

使用Theil不确定性系数(U)量化质粒的地理关联。对于每种质粒类型，我们构建了质粒在各国和细菌分支中存在/不存在的列联表。计算Theil's U以测量地理起源或细菌分支解释的质粒分布不确定性的比例。

系统发育和群体结构分析

为了重建CC23的进化历史，我们使用EToKi包进行了核心基因组系统发育分析。EToKi使用minimap2-2.28将所有CC23基因组比对到一个单一参考基因组(GCA_027594925)，并使用RecHMM识别和去除重组区域。使用IQ-TREE2 v.2.4.0在GTR + GAMMA模型下构建最大似然系统发育树。使用TreeTime v0.11.0中实现的随机特征映射推断碳青霉烯酶基因和毒力基因的获得/缺失。

对于CC23-K1谱系的分析，我们基于初始系统发育分析提取了属于该谱系的2220个基因组，并生成了单独的重组过滤比对。使用与上述相同的方法构建CC23-K1系统发育树。使用rhierBAPs识别CC23-K1中的主要分支(https://github.com/gtonkinhill/rhierbaps)。我们使用以下参数运行分析：最大聚类数设置为20，允许两级聚类，使用10个独立的随机起始配置来提高聚类分配的稳健性。我们目视检查结果，只保留第一级，因为第二级与系统发育不一致。

计算所有分离株对的成对SNP距离，确定93个SNPs的距离阈值作为使用Fisher精确检验分离同一聚类内CRKPs与聚类间CRKPs的最佳阈值。该阈值用于定义遗传模块，如果分离株差异少于93个SNPs则连接。使用Gephi v0.11.0进行网络可视化(https://gephi.org/)。

时间分析和系统地理学

为了研究CC23-K1的时间动态，使用TempEst v1.5.3评估数据集中的时间信号。我们使用TreeTime v0.11.0进行时间校准系统发育分析，采用松弛分子钟模型，该模型自动识别并排除具有过长分支的异常值。使用20个时间间隔的天际线方法估计有效群体大小。此外，我们使用BEAST v2.6.8进行贝叶斯进化分析。由于数据集较大，实施了如先前描述的子采样策略，将CC23-K1菌株分为四个相等的子组进行并行推断。

对于每个子组，我们评估了四种替代模型：(1)严格时钟与恒定群体大小，(2)严格时钟与扩展贝叶斯天际线图，(3)松弛时钟与恒定群体大小，(4)松弛时钟与扩展贝叶斯天际线图。使用嵌套采样进行模型选择。最优模型，松弛时钟与扩展贝叶斯天际线图，进行100亿代的长运行。前10%的样本作为老化期丢弃。使用Tracer v1.7.1评估收敛性，确保所有参数的有效样本量>200。

使用TreeTime中实现的随机特征映射推断地理传播模式。为了解决采样偏差，我们如先前描述的进行了100次随机下采样，每次迭代每个国家选择最多10个基因组。从祖先状态重建中提取传播事件，使用Gephi可视化传播网络。使用Louvain社区检测算法将国家聚类为模块。

肺炎克雷伯菌的物种级分析

为了将CC23-K1置于更广泛的肺炎克雷伯菌群体中，我们分析了来自NCBI GenBank的80,300个公开可获得的肺炎克雷伯菌基因组。使用Kleborate v3.1.3确认物种识别，该工具还分配序列类型并检测抗菌药物耐药性和毒力基因。

基于毒力评分≥3识别高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)分离株，这与iuc基因座的存在相关。一些iuc基因座由于突变或插入/缺失对其编码框的破坏而被视为缺失。基于相关基因的存在识别产碳青霉烯酶分离株。

对于全球分布分析，按国家、大陆和序列类型对分离株进行分类。使用Fisher精确检验比较碳青霉烯耐药和碳青霉烯敏感分离株之间毒力基因频率的统计差异，对多重比较进行Bonferroni校正。

小鼠感染模型

本研究使用8周龄雌性C57BL/6J小鼠进行毒力评估。小鼠腹腔接种5×10^5菌落形成单位(CFUs)的肺炎克雷伯菌细菌悬液，体积为200μL。感染后，每日监测动物14天，观察疾病的临床症状，包括体重下降、活动能力降低和异常呼吸。严格执行人道终点以减少动物痛苦，如体重下降超过基线20%、持续不动或呼吸困难，在研究终点前人道安乐死。对每株菌6只小鼠进行生存分析。使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验分析生存率；p < 0.05被认为差异具有统计学意义。

肺炎克雷伯菌6113 ΔCPS突变株的构建

使用λ Red依赖性重组系统和FLP/FRT系统构建肺炎克雷伯菌6113 Δwcaj突变株（ΔCPS）。首先，通过Gibson组装构建包含wcaJ基因上游和下游各500 bp以及潮霉素耐药基因的供体DNA片段。从pUC19-Hph质粒PCR扩增被FRT位点侧翼的潮霉素耐药基因。通过电穿孔将携带λ Red操纵子和阿普霉素耐药基因的pKOBEG质粒导入6113菌株。用阿拉伯糖诱导后，将供体DNA电穿孔导入6113菌株，用潮霉素耐药基因替换wcaJ基因。在含有阿普霉素和潮霉素的LB琼脂平板上选择突变株，并通过PCR和测序确认。通过在42°C培养突变株去除pKOBEG质粒。

接合试验

如先前报道进行接合试验。供体菌株大肠杆菌C600（携带blaNDM-1）和受体菌株（KL1型肺炎克雷伯菌6113野生型菌株和ΔCPS突变株）过夜培养，然后在LB培养基中37°C以1:100稀释继代培养至OD600为0.7。对于去聚合酶处理组，肺炎克雷伯菌6113菌株在与供体菌株混合前用K1荚膜多糖去聚合酶（20μg/mL）在37°C处理30分钟。等体积的供体和受体细胞以1:1比例混合，用PBS缓冲液洗涤，重悬于50μL 10 mM MgSO₄中。然后将细胞悬液接种在LB琼脂平板表面的0.45μm孔径硝酸纤维素滤膜上，37°C培养7小时。培养后，从滤膜上回收细胞，重悬于PBS缓冲液中，进行系列稀释。将细菌悬液铺在含有或不含有4μg/mL美罗培南的MIAC琼脂上，以确定接合频率。

荚膜产生的竞争性ELISA

如先前报道进行竞争性ELISA。通过与肺炎克雷伯菌6113 ΔwcaJ突变株培养吸附针对K1多糖的兔抗血清，以去除可能在iELISA中交叉反应的OPS和核心特异性抗体。将OD 1.5的肺炎克雷伯菌菌株用4%多聚甲醛固定，然后2.5倍系列稀释，与吸附的K1抗血清在37°C培养2小时。iELISA板用纯化的K1多糖(5.0μg/mL)和甲基化人血清白蛋白（1.0μg/mL）在37°C包被3小时。洗涤板后用5%小牛血清(150μL/孔)在37°C封闭1小时，洗涤两次。然后将与不同稀释肺炎克雷伯菌菌株培养的K1抗血清上清液加到iELISA板上，4°C过夜。洗涤板后与AP山羊抗兔免疫球蛋白G（1/20000稀释，100μL/孔）在25°C培养2小时，洗涤5次，与显色试剂(100μL/孔)在25°C培养2小时。用3M NaOH终止后记录A405。K1荚膜多糖(1860μg/ml)，2.5倍系列稀释，与吸附的K1抗血清培养用于iELISA构建标准曲线。从标准曲线计算肺炎克雷伯菌菌株的K1荚膜量。

高突变区域(HMRs)的识别

为了识别处于多样化选择下的基因组区域，我们计算了CC23-K1谱系中所有蛋白编码基因和基因间区域的突变频率。从该分析中排除了重组事件引入的突变。对于每个基因和基因间区域，我们进行Fisher精确检验，比较观察到的突变频率与其他区域的频率。使用Bonferroni校正进行多重检验评估统计显著性。

高突变区域（HMRs）定义为具有显著更高突变频率的基因或基因间区域(校正p值 < 0.01)。使用单因素方差分析评估突变频率的地理变异，按大陆分组国家以确保足够的样本量。

对于与ST11谱系的比较分析，我们对从先前研究收集的1,200个ST11基因组数据集应用相同的方法。

耐药相关区域(RARs)的识别

对于耐药相关区域（RARs）的识别，我们使用单因素方差分析和Tukey HSD事后检验进行了三个独立的比较分析：

1. 携带blaKPC/blaNDM碳青霉烯酶的分离株（A组）与携带其他碳青霉烯酶类型的分离株（B组）

2. ESBL阳性分离株(A组)与ESBL阴性分离株（B组）

3. 毒力基因集不完整的分离株(A组)与毒力基因集完整的分离株（B组）

对于每个比较，我们计算A组和B组之间每个基因的平均SNP频率差异。负值表示B组对该特定基因具有比A组更高的突变率，而正值表示A组具有更高的突变率。我们对ESBL阳性与ESBL阴性菌株以及完整与受损毒力基因集进行了类似的比较。在所有三个比较中表现出 ≥ 0.5 SNPs/基因的平均差异且p < 0.01(Bonferroni校正)的区域被指定为RARs。

功能和地理富集分析

为了表征HMRs的功能意义，我们使用R包'clusterProfiler'（v4.0.5）进行KEGG通路富集分析。位于HMRs内或邻近的基因用作输入。我们认为校正p值 < 0.05的通路为显著富集。

为了研究突变模式的地理变异，我们计算每个菌株从根部累积的变异，并按分离国家分组菌株。我们进行单因素方差分析，比较每个HMR在各地区间累积变异的数量。通过比较个别国家菌株的突变频率与总体分布确定地理特异性（Bonferroni校正后p < 0.01）。

统计分析

使用R v4.1.0进行统计分析。使用适当的统计检验评估组间差异，包括Student's t检验和Fisher精确检验。p值小于0.05被认为具有统计学意义。使用单因素方差分析和Tukey HSD事后检验进行组比较。对其他多重独立检验应用Bonferroni校正。

使用线性回归分析评估地理距离与传播频率之间的相关性。国家间地理距离计算为国家质心间的大圆距离，分析前进行对数转换。

代码和数据可用性：

所有测序数据已存储在NCBI GenBank的BioProject登录号：PRJNA1236717下(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1236717)。组装的基因组也可在以下网址获得：https://github.com/puff0916/ST23_kle。使用的数据和脚本保存在GitHub：https://github.com/Zhou-lab-SUDA/Wu_iMeta_ST23_Figure_sources。所有样本的详细样本登录号列表见表S2。补充材料(图片、表格、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新材料)可在在线DOI或iMeta Science http://www.imeta.science/找到。

引文格式：

Yuchen Wu, Fan Pu, Zelin Yan, Yanyan Zhang, Kaichao Chen, Shengkai Li, Yuezhuo Wang, et al. 2025. “Geographic containment and virulence-resistance trade-offs drive the evolution of hypervirulent Klebsiella pneumoniae.” iMeta 5: e70077. https://doi.org/10.1002/imt2.70077.