VLP疫苗纯化：确保疫苗品质与安全的关键技术

在现代疫苗学领域，病毒样颗粒（Virus-like Particles, VLPs）是一种新兴的疫苗平台。VLPs不含病毒基因组、不具备复制能力，却能高度模拟天然病毒的形态和抗原性，从而引发强大的免疫反应。它不仅具有良好的生物安全性，还具备可工程化的特性，能够搭载多种抗原，已成为预防传染病、甚至开发肿瘤治疗性疫苗的重要工具。

然而，VLP复杂的结构、显著的尺寸异质性以及不同表达系统产生的多样化工艺及产品相关杂质，使得其下游纯化成为限制疫苗产品质量、产量和可制造性的关键瓶颈。

一、保障VLP疫苗结构与免疫原性的纯化策略

VLP作为疫苗，其引发强大免疫应答的能力，与其高阶结构的完整性及抗原表位的正确呈现密切相关。由于VLP是多蛋白亚基组装的超分子复合物，对pH、离子强度、温度、剪切力等环境因素高度敏感。因此，纯化过程需采取温和策略，以维持其疫苗活性。

缓冲体系优化：缓冲体系是VLP疫苗稳定性的基础。需要系统评估pH值、离子强度、离子种类，并引入非离子表面活性剂以减少界面应力，以及糖类或多元醇作为稳定剂，以提升VLP的热稳定性和冻融稳定性。目标是识别并控制关键参数，以维持VLP在整个纯化流程中的结构完整性，确保抗原表位的稳定呈现。

温和型层析技术：传统层析介质的狭窄孔径常导致VLP滞留、聚集和结构变形，进而影响其免疫原性。为此开发了温和型层析技术：

宏孔介质：具有大于100纳米孔径的介质，可以使VLP顺利进入内部孔隙，通过对流传质而非慢速扩散，显著提高结合容量和回收率，并更好地维持VLP结构完整性。

膜层析：利用功能化宏孔膜作为基质，传质以对流为主，VLP在膜表面快速完成吸附，大幅缩短处理时间，减少剪切应力，保护VLP结构。

二、VLP疫苗异质性管理的精细化路径

VLP疫苗产品异质性直接影响其安全性、有效性和稳定性。杂质可分为工艺相关杂质和产品相关杂质。下游纯化必须旨在去除这两类杂质，以确保疫苗纯度高、安全性好。

澄清处理：这是降低杂质负荷的首要步骤。对于胞内表达的VLP，需先进行细胞破碎，然后通过离心或深度过滤去除细胞碎片、大颗粒及其他不溶物。深度过滤结合尺寸排阻、静电吸附和疏水作用，能有效去除内毒素等，为后续精细纯化奠定基础，降低疫苗潜在的副作用。核酸酶处理可进一步降解残留的宿主核酸。

超滤/渗滤（UF/DF）： UF/DF利用具有特定孔径的膜进行分子筛分，实现VLP的浓缩、缓冲液交换和杂质去除。通过选择适当的截留分子量，可有效保留VLP，同时让残留洗涤剂等小分子杂质通过。在解聚/重组流程中，UF/DF也是转换缓冲体系的关键工具，有助于提高疫苗纯度。

高分辨层析技术：提供VLP与各类杂质之间高效分离的手段。

尺寸排阻层析： 根据分子水动力学尺寸分离，常用于去除低分子量杂质，并分离完整VLP与未组装蛋白或更小的低聚物，确保疫苗组分均一。

离子交换层析： 根据表面电荷差异分离。阴离子交换层析（AEX）尤其擅长去除强负电荷的HCD，也可去除HCPs、细胞外囊泡及不完整颗粒，降低疫苗潜在的致敏性或炎症反应。

疏水相互作用层析：利用分子表面疏水性差异。VLP因其高度有序的表面拓扑结构，常表现出较强的疏水性，可在高盐条件下有效结合，并通过梯度洗脱去除HCPs、HCD。

亲和层析：利用特异性生物相互作用，如肝素亲和层析可选择性捕获具有特定表面结构域的VLP。通过基因工程引入亲和标签也可扩展其应用范围，实现高效特异性纯化。

多模式层析：结合多种相互作用（如离子交换与疏水作用），能有效分离与VLP理化性质相似的“顽固”杂质和产品相关变体，最大化疫苗纯度。

三、确保VLP疫苗产品病毒安全性

作为生物制品，VLP疫苗必须高度纯化且不含微生物污染，特别是潜在的病毒污染。法规机构强调通过起始物料风险控制、生产过程病毒检测以及下游病毒清除/灭活验证来确保疫苗的病毒安全性，这是任何疫苗上市的先决条件。

不同表达系统的病毒清除要求：

大肠杆菌和酵母：由于动物病毒无法在这些系统中复制，通常不要求进行下游病毒清除。

CHO细胞：作为哺乳动物细胞宿主，存在表达内源性逆转录病毒样颗粒及引入外源病毒的风险，因此必须进行病毒安全性评估，并可能需要病毒清除步骤。

昆虫细胞-杆状病毒表达系统： VLP疫苗生产过程中不可避免地伴随大量感染性杆状病毒的共生产。指南已明确规定，使用杆状病毒作为辅助病毒的表达系统，纯化过程必须包含病毒清除步骤并进行相关验证，以确保最终疫苗产品的安全性。

VLP疫苗下游病毒清除策略：通常推荐至少两种作用机制互补的病毒清除步骤，其中一种需能有效清除非囊膜病毒，以应对不同类型的潜在病毒污染物。

化学灭活：利用溶剂/去污剂处理或低pH孵育来灭活病毒。这些方法主要针对有包膜病毒，但需评估其对VLP疫苗结构和免疫原性的潜在影响。

层析技术：离子交换层析和多模式层析在病毒清除中发挥重要作用。例如，在流穿模式下，病毒表面通常带强负电荷，可被带正电荷的配体介质吸附，而VLP流穿，实现高效分离，有效降低病毒载量。

病毒过滤：利用纳米级多孔膜的尺寸排阻原理去除病毒。然而，VLP本身的尺寸可能接近或超过滤膜孔径，因此需根据VLP特性设计过滤策略：

可逆解聚的VLP：若VLP疫苗能在特定条件下解聚成较小的单体蛋白，通过小孔径病毒滤膜后再重组，是理想的清除策略。

20–50纳米且不可解聚的VLP：可使用35或50纳米大孔径滤膜，允许VLP通过，同时截留较大病毒；但需补充层析步骤以清除小型病毒。

尺寸过大且不可解聚的VLP：需与监管机构沟通，评估产品特异性考量，可能通过优化表达系统或分子设计来满足病毒清除要求，确保疫苗安全。

VLP的表达已经是病毒研究的基础平台，然而对于疫苗方向的VLP纯化还有很多需要细化的步骤来保证疫苗结构、功能和安全性。

参考资料：Zhang, J.; Chen, C. Downstream Purification Strategies for Virus-like Particles: A Systematic Review of Structure Preservation, Impurity Control, and Viral Safety. Microorganisms 2026, 14, 858.