希伯来大学Yassour团队揭示多雷拟杆菌利用唾液酸化母乳低聚糖分子机制

外分泌型母乳低聚糖是母乳核心功能组分，无法被婴儿自身消化吸收，仅能作为肠道共生菌专属碳源。过往母乳低聚糖代谢研究集中于双歧杆菌属，拟杆菌对该类聚糖的分解通路长期缺乏完整验证。

现有临床样本证实九成母乳喂养婴儿肠道无双歧杆菌定植，拟杆菌属丰度与母乳低聚糖含量显著关联，但拟杆菌分解唾液酸化母乳低聚糖的关键基因簇与核心功能基因尚未明确。

2024年1月2日，希伯来大学Moran Yassour团队在Nature Communications刊发题为CRISPR-Cas-based identification of a sialylated human milk oligosaccharides utilization cluster in the infant gut commensal Bacteroides dorei的研究论文。

该研究从婴儿粪便分离多雷拟杆菌天然菌株，借助转录组与CRISPR-Cas12基因编辑锁定PUL33基因簇为唾液酸化母乳低聚糖代谢必需元件，证实GH33唾液酸酶是通路核心功能蛋白，异源回补实验验证该基因簇具备独立聚糖分解能力。研究完善婴儿肠道母乳低聚糖代谢网络，为婴幼儿益生菌筛选、配方奶HMO添加提供分子依据。

正 文

研究人员首先采集母乳喂养婴儿粪便样本，分离两株多雷拟杆菌与六株普通拟杆菌天然分离株，设置岩藻糖化，中性，唾液酸化三类母乳低聚糖单一碳源培养体系，监测菌株生长动力学数据。实验结果显示全部菌株均可利用母乳低聚糖，但唾液酸化与中性母乳低聚糖生长效率显著优于岩藻糖化底物，菌株基因组统计发现岩藻糖苷酶编码基因拷贝数远高于唾液酸酶，该生长表型与基因丰度存在明显反差。研究人员筛选多雷拟杆菌开展RNA-seq转录组分析，对比葡萄糖对照组与3’-SL，6’-SL处理组基因表达，PUL33基因簇在唾液酸化母乳低聚糖诱导下特异性大幅上调，该基因簇内GH33基因表达倍数达到五十倍以上，其余65个多糖利用位点无同步上调特征。

为验证PUL33基因簇的生理必要性，研究人员适配CRISPR-Cas12无标记基因编辑体系，对红霉素敏感多雷拟杆菌天然菌株敲除PUL33内五千碱基功能区段，获得Δ5k-PUL33敲除突变株。体外碳源培养实验证明突变株完全丧失3’-SL与6’-SL利用能力，岩藻糖化，中性母乳低聚糖代谢不受影响。研究构建包含GH20，GH33，SusD，SusC四个核心基因的回补质粒转入突变株，完整回补菌株可恢复野生型水平的唾液酸化母乳低聚糖生长能力。团队选取无同源PUL33的均匀拟杆菌，粪拟杆菌作为异源宿主，转入全套PUL33核心基因后两种菌株均获得唾液酸化母乳低聚糖分解功能，证明该基因簇功能不依赖多雷拟杆菌胞内特有环境。

研究人员构建四类局部回补质粒开展分段功能验证，仅携带GH33的质粒可恢复突变株底物利用能力，缺失GH33的回补菌株完全无法利用唾液酸化母乳低聚糖，确定GH33为通路不可替代核心元件。团队利用AlphaFold预测多雷拟杆菌GH33蛋白三维结构，与多形拟杆菌已解析同源晶体结构比对，二者催化口袋与底物结合沟槽高度保守，仅一处沟槽疏水残基存在差异，宽开放活性沟槽结构赋予GH33广谱唾液酸化聚糖底物识别能力。系统发育分析显示多雷拟杆菌与普通拟杆菌GH33序列相似度达97.44%，与多形拟杆菌同源性仅67.65%，SusC转运蛋白序列分化程度更高，提示不同拟杆菌属进化出结构差异化但功能趋同的唾液酸化母乳低聚糖代谢通路。

B. dorei 的 GH33 的预测结构类似于 B. thetaiotaomicron 已解析晶体结构的 GH33 唾液酸酶

总 结

总的来说，该研究完成婴儿肠道多雷拟杆菌天然菌株的体外碳源筛选，借助转录组筛选，CRISPR基因敲除，基因回补异源表达三重实验，完整阐明PUL33多糖利用位点介导唾液酸化母乳低聚糖分解的完整通路，明确GH33唾液酸酶是通路决定性功能基因，同时对比拟杆菌与双歧杆菌的母乳低聚糖代谢偏好，解释两类共生菌在婴儿肠道生态位互补的分子基础。