本研究首次以肠炎沙门氏菌关键毒力因子SipD蛋白为靶标，通过免疫羊驼成功构建了噬菌体展示纳米抗体文库，并筛选获得两株特异性纳米抗体Nb3和Nb89。基于此开发的夹心ELISA方法以Nb89为捕获抗体、HRP标记的Nb3为检测抗体，检测限达9.5×10⁴ CFU/mL，可特异性识别肠炎沙门氏菌，与鸡白痢沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、福氏志贺菌等7种食源性病原体无交叉反应。在鸡肉、鸡肝和鸡蛋样品中的加标回收率为85.5%–109.4%，变异系数低于10%。分子对接和动力学模拟揭示了纳米抗体与SipD蛋白的结合机制。本研究为禽类产品中肠炎沙门氏菌的快速检测提供了新策略，并展示了羊驼纳米抗体在病原诊断中的应用潜力。
肠炎沙门氏菌是全球食源性疾病的主要病原体之一，广泛存在于禽类产品中，可通过污染鸡蛋、鸡肉等途径传播给人类，严重威胁食品安全和公共卫生。传统的基于单克隆抗体或多克隆抗体的检测方法存在制备繁琐、批次间稳定性差、耐热性有限等不足。纳米抗体作为源自骆驼科动物的重链抗体可变区，具有分子量小（12–15 kDa）、溶解性好、热稳定性高、易于基因工程改造和微生物系统生产等独特优势。III型分泌系统的针尖蛋白SipD是肠炎沙门氏菌的关键毒力因子，在细菌入侵宿主细胞过程中发挥重要作用，其序列高度保守且位于细菌表面，是理想的检测靶标。本研究首次以SipD蛋白为免疫原，利用羊驼这一新型实验动物资源，开发了基于双纳米抗体的夹心ELISA方法，为禽类产品中肠炎沙门氏菌的检测提供了新工具。
纳米抗体文库的构建与特异性纳米抗体的筛选
研究者首先通过原核表达系统制备了SipD重组蛋白，SDS-PAGE显示其分子量约为55 kDa，Western blot证实其可被肠炎沙门氏菌阳性血清特异性识别，具有良好的抗原性和免疫原性。以该蛋白免疫成年雄性羊驼，六次免疫后血清抗体效价达1:256,000，表明成功诱导了强免疫应答。从外周血淋巴细胞提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段，构建了容量约2.4×10⁹ CFU的噬菌体展示纳米抗体文库，插入率达91%，序列分析显示文库具有良好的多样性。经过四轮亲和筛选，噬菌体回收率从2×10⁻¹⁰逐步提升至3.2×10⁻⁶，表明SipD特异性噬菌体得到了有效富集。从96个随机克隆中通过噬菌体ELISA鉴定出8个阳性克隆，测序后最终确定两株序列不同的特异性纳米抗体，命名为Nb3和Nb89。
纳米抗体的表达、纯化与生物学特性分析
将Nb3和Nb89基因分别克隆至pET-28a载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，经Ni-NTA亲和纯化后获得纯度较高的重组蛋白，SDS-PAGE显示分子量约为18 kDa，与预期一致。间接ELISA结合实验表明，两株纳米抗体对SipD蛋白均具有良好的结合活性。热稳定性实验显示，Nb3和Nb89在25–95°C处理5分钟后仍保留60%以上的抗原结合能力，在85°C处理长达60分钟后活性仍保持较高水平，显示出优异的热稳定性。特异性分析表明，两株纳米抗体仅与肠炎沙门氏菌结合，对鸡白痢沙门氏菌、哈达尔沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、福氏志贺菌和致病性大肠杆菌等7种常见食源性病原体均无显著交叉反应，显示出高度的特异性。
基于Nb3-HRP的夹心ELISA方法的建立
研究者将Nb3基因克隆至真核表达载体pCMV3，在HEK293细胞中表达Nb3-Fc融合蛋白，并通过高碘酸钠氧化法将其与HRP偶联，制备了Nb3-HRP检测抗体。通过正交实验优化捕获抗体和检测抗体的配对组合及工作浓度，最终确定以Nb89为捕获抗体（100 ng/孔）、Nb3-HRP（1:50,000稀释）为检测抗体的最佳组合，P/N比值达34.66。在最优条件下建立了标准曲线，采用四参数Logistic方程拟合（R²=0.998），检测限为9.5×10⁴ CFU/mL，线性范围为4.2×10⁵–5.3×10⁷ CFU/mL。特异性验证显示，该方法仅对肠炎沙门氏菌产生阳性信号，与7种其他食源性病原体（浓度均为10⁸ CFU/mL）无交叉反应。
实际样品检测与识别机制解析
将肠炎沙门氏菌以10⁶、10⁷、10⁸ CFU/mL三个浓度分别加标至SPF鸡的鸡肉、鸡肝和鸡蛋样品中，采用建立的方法进行检测。结果显示，加标回收率在85.5%–109.4%之间，变异系数均低于10%，证实该方法在实际样品检测中具有良好的准确性和可靠性。
为进一步阐明纳米抗体的识别机制，研究者利用AlphaFold3软件构建了Nb3和Nb89的三维结构模型，模型评估（Ramachandran图、ERRAT、Verify3D）确认了结构的可靠性。分子对接分析显示，两株纳米抗体主要通过CDR1、CDR2和CDR3区的口袋与SipD蛋白结合，其中Nb3与SipD形成7个氢键，结合能为–38.53 kcal/mol，优于Nb89（4个氢键，–25.35 kcal/mol）。分子动力学模拟表明，Nb3-SipD复合物的RMSD波动范围（0.37–0.42 nm）小于Nb89-SipD复合物（0.3–0.4 nm），提示Nb3具有更强的结合稳定性和亲和力。这一计算预测与实验中Nb3表现出的更高结合活性一致，也为后续纳米抗体的定向优化提供了理论基础。
文献链接：https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2025.111776
