一种靶向活的非致病/致病副溶血性弧菌的多重qPCR定量方案

  Vp是20世纪50年代发现的一种革兰氏阴性嗜盐菌，广泛分布于海洋和河口环境中，是中国和其它东南亚国家的主要食源病原体。Vp的毒力因素包括：耐热性直接溶血素(Thermostable direct hemolysin, TDH)、耐热直接溶血素相关溶血素(TDH related hemolysin, TRH)、粘附因子、III型分泌系统(T3SS1和T3SS2)、VI型分泌系统(T6SS1和T6SS)。其中尤以TDH和TRH最为重要。

  病原快速检测能够有效地提高对微生物食品安全的管理。然而，现有Vp的检测方法，包括病原的分离-培养-鉴定(TCBS)和PCR，仍然具有周期长和劳动密集的缺点。此外，传统的培养方法很难培养活的但不可培养细菌(VBNC)，而Vp已被证明在逆境中很容易进入VNBC状态。这种状态下的细菌失去分裂的能力，但能够继续维持代谢、基因表达、保持抗生素耐药性以及致病特性;PCR则面临着无法区分活/死细菌的挑战。另外，目前鲜有方法实现致病/非致病Vp的区分，而这一点在食品安全中非常重要。因而，基于上述3点，本文建立了一种PMA-qPCR方法，用于致病/非致病Vp的定量检测。PMA的工作原理可以解释为：一种能与DNA结合的光反应染料，不具有细胞膜渗透性，无法穿透活细胞完整的细胞膜，只能选择性地穿透死细胞受损的细胞膜。进入细胞后，PMA会与DNA双螺旋发生共价交联，进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增。研究中，作者采用2管3重检测的方式，一管检测Vp(tlh)，一管同时检测(tdh和trh)。在内容上，优化了PMA的处理浓度、时间;光照时间以及震荡速度，评价了方法的特异性，并用模拟样本和实际样本评估了所建立方法的实用性。总的来说，尽管该方法并无很强的创新性，但是它引入PMA趋避了普通qPCR的一大缺陷，且具有很强的应用价值。

  原文doi：10.3389/fmicb.2018.01747