给细菌做“减法”——PfAgo精准切割+SERS信号转换，无扩增检出沙门氏菌

食源性致病菌尤其是鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）严重威胁食品安全与公共卫生。传统平板培养耗时长（24–48 h以上），qPCR虽灵敏却依赖核酸预扩增，易带来气溶胶污染导致假阳性，且CRISPR/Cas系统通常受PAM序列限制。Argonaute（Ago）蛋白可不依赖PAM、以单链DNA为向导精确切割靶标DNA，但在无需扩增的直接检测中应用仍有限。本研究将PfAgo的序列特异性切割活性与表面增强拉曼散射（SERS）的指纹光谱检测相结合，构建了名为PAF-SERS（PfAgo-mediated Amplification-Free SERS Biosensor）的无扩增、免预扩增沙门氏菌检测平台。

检查原理与探针构建

平台以4-巯基苯甲酸（4-MBA）标记的金纳米粒子（AuNPs@4-MBA@ssDNA）为SERS纳米探针，磁珠偶联生物素化ssDNA。靶标DNA存在时，PfAgo在gDNA引导下切割产生"linker DNA"，桥接磁珠与Au探针，经磁分离后上清剩余探针与AgNPs@PVA混合增强，测得1075 cm⁻¹处特征峰信号——靶标越多，信号越低（信号转化检测模式）。

图1 PAF-SERS生物传感器示意图^[1]

材料表征与可行性验证

TEM、DLS、Zeta电位、EDS及UV-Vis证实Au-Ag复合纳米结构及MBs@AuNPs成功制备，4-MBA特征拉曼峰明显。PfAgo活性荧光验证SNR达20.5；无论质粒DNA还是鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA，完整体系出现显著SERS信号下降，缺任一组分则信号无变化，确证PfAgo引导切割与SERS信号转换的可行性。

图2 基于金纳米颗粒的表面增强拉曼散射探针的制备与表征^[1]

反应条件优化

系统优化确定PfAgo 1.32 μM、gDNA 0.5 μM、反应40 min、产物加样20 μL、磁珠3 mg/mL、Au:Ag=2:1为最佳条件，保障最低背景与最强SERS强度。

图3 PAF-SERS生物传感器的优化^[1]

灵敏度、特异性与稳定性

在最优条件下，免扩增直接检测LOD低至10 CFU/mL，线性范围10¹–10⁷ CFU/mL（R²=0.994）；对11株非靶标菌无交叉反应；探针4℃保存5周信号稳定，批内/批间RSD＜7%。

图4 PAF-SERS传感器的灵敏度与性能评估^[1]

SVM算法辅助判读

针对低浓度样本与阴性对照光谱相似难区分的问题，引入SG滤波-PCA-SVM分类模型，成功区分阴/阳性，五折交叉验证准确率99.31%。30例盲样双盲检测PAF-SERS准确率100%，优于qPCR-TaqMan（AUC=0.93）和qPCR-SYBR（AUC=0.92），无扩增污染导致的灰区或假阳/假阴。

图5 PAF-SERS与qPCR的检测性能比较^[1]

食品与实际样本验证

牛奶、鸡蛋、鸡肉人工污染样本中LOD均为10² CFU/mL（经10倍稀释前处理），平均回收率99.5%–106%，抗基质干扰良好。

图6 PAF-SERS用于检测鸡蛋、牛奶和鸡肉中的污染样本^[1]

感染小鼠模型应用

灌胃或尾静脉注射感染小鼠后，PAF-SERS成功追踪粪便及血液中沙门氏菌载量动态变化——感染后12–24 h达峰，120 h降至基线，与qPCR一致；组织（结肠、盲肠、肝、脾）检测亦呈阳性，炎性因子（IL-6、TNF-α、CRP）及中性粒细胞变化趋势与菌载相符，组织病理可见相应炎症损伤。

图7 基于PAF-SERS生物传感器的鼠模型中沙门氏菌检测^[1]

结论

本研究首次将PfAgo无PAM限制的特性与SERS信号转化检测耦合，建立了55分钟内完成、无需核酸扩增、LOD达10 CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌免扩增检测方法，并通过SVM算法显著提升低浓度样本判别可靠性。该方法在食品（奶/蛋/肉）及感染动物生理样本（粪便、全血、组织）中均表现良好，克服了传统qPCR扩增污染风险及CRISPR系统PAM依赖问题。

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参考文献：

[1] Zhao et al., PfAgo-guided SERS signal conversion for amplification-free and semi-quantitative detection of Salmonella typhimurium in food and physiological samples. Journal of Hazardous Materials, 2026, 511: 142193. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.142193.