温和噬菌体在生物膜内部及生物膜之间的空间传播

成熟生物膜像一座细胞堆成的城堡，噬菌体从外面进来时，很难直接打到城堡中心，只能主要在外层活动。温和噬菌体 λ 的特别之处在于，它不只是杀细菌，还会把一部分外层细菌变成带有噬菌体基因的溶原菌。这些溶原菌刚好位于容易被水流带走的外缘，于是它们会随水流离开原来的生物膜，去新的地方建立含有更多溶原菌的新生物膜。这样看，温和噬菌体不是靠强行穿透整座生物膜取胜，而是靠搭上宿主细胞这辆车，在更远的空间和更长的时间里传播。

细菌在自然界和医学环境中经常不是单个漂浮生活，而是形成附着在表面的群体，也就是生物膜。生物膜由细胞和胞外基质共同组成，能够保护细菌免受抗生素、竞争者、捕食者和噬菌体攻击。过去关于裂解型噬菌体如何进入生物膜、如何被生物膜结构阻挡，已经有一些显微尺度研究；但温和噬菌体不一样，它既可以裂解宿主，也可以把自己的基因组留在宿主体内形成溶原菌。这个双重生活史让它在生物膜中可能有完全不同的传播策略。作者想回答的是，温和噬菌体进入生物膜后，到底在哪里感染细菌，哪些细胞会变成溶原菌，生物膜结构会不会限制它传播，这些溶原菌又会不会更容易从原来的生物膜里脱落并去到新的地方。

这项研究的意义在于，它把温和噬菌体和生物膜的关系从整体平均结果推进到了单细胞和空间结构层面。传统实验如果把生物膜打散再测，只能知道最后有多少细胞被感染、多少噬菌体释放出来，却看不到感染发生在生物膜的哪个位置，也看不到空间位置怎样影响后续扩散。作者强调，温和噬菌体非常普遍，而且前噬菌体能改变细菌生理，包括抗生素抗性、代谢能力和毒力；溶原菌还会获得对相同或近缘噬菌体的免疫。因此，弄清温和噬菌体在生物膜里的空间传播，不只是理解噬菌体生态，也关系到水平基因转移、病原菌演化和生物膜感染控制。

在方法上，作者建立了一个可以用显微镜同时区分未感染细菌、溶原菌、裂解感染和噬菌体颗粒的模型系统。宿主是 E. coli AR3110，这是一个恢复了生物膜基质生产能力的 K-12 衍生株，作者让它持续表达远红色荧光蛋白 mKate2。生物膜在微流控装置里生长，装置通道长 5000 μm、宽 500 μm、高 70 μm；细菌先静置 45 分钟 附着到玻璃表面，然后在含 0.5% maltose 的 M9 最小培养基中，以 0.1 μL/min 的流速培养。选择 maltose 是为了让宿主表达 LamB，因为 LamB 是 λ 噬菌体吸附宿主的受体。生物膜通常先长 48 小时，随后切换为含 λ 噬菌体的培养基继续流动培养。作者使用的 λ 噬菌体带有两套荧光标记：衣壳蛋白 gpD 融合 mTurquoise2，用于看到噬菌体颗粒；cI 位点下游带有 mKO2 转录融合，使被溶原化的宿主呈橙色。这样，未感染宿主、溶原菌、正在发生裂解感染的细胞和游离噬菌体都能在活体生物膜中被空间追踪。

文章最先发现，λ 噬菌体进入成熟 E. coli 生物膜后，并不能均匀进入整个细胞团。小而疏松的细胞团容易被裂解并从系统中移除；较大、较致密的细胞团则出现了清楚的分层结构：外围有很多 λ 噬菌体、新形成的溶原菌和仍未感染的宿主，而高度致密的中心核心区域几乎没有噬菌体，也没有溶原菌。也就是说，成熟生物膜的中心像一个避难区，噬菌体主要被限制在外围活动。第 3 页图 1 很直观地展示了这一点：野生型生物膜中，蓝绿色噬菌体和黄色溶原菌集中在紫色细胞团外缘；而在缺失 curli 基质的 ΔcsgBA 突变株中，噬菌体和溶原菌分布明显更均匀。

这个空间限制和生物膜基质特别是 curli 淀粉样纤维 密切相关。作者使用缺失 csgB 和 csgA 的 ΔcsgBA 菌株进行对照，这个突变株不能正常产生 curli，因此细胞间黏附和高密度堆积能力下降。结果显示，在 ΔcsgBA 生物膜里，λ 噬菌体和溶原菌几乎可以分布到整个细胞群中，而不是只停留在外围。作者还检测了噬菌体抗性突变，发现实验结束后存活群体中 λ 抗性频率大约只有 10^-5，与起始培养物的背景抗性频率没有显著差异，所以这些现象不是因为细菌迅速进化出了遗传抗性，而主要是由生物膜空间结构限制噬菌体扩散造成的。

作者进一步用 BiofilmQ 分析局部细胞堆积密度，发现溶原菌明显富集在低细胞堆积区域。野生型生物膜中，溶原菌的分布偏向细胞团外缘那些松散区域，而且溶原菌所在位置的细胞堆积密度比整体宿主群体更低。λ 噬菌体本身的分布也偏外缘，但溶原菌出现的位置比噬菌体扩散范围还更偏低密度区域，说明 24 小时时溶原化还没有完全追上噬菌体能够到达的全部空间。到了 ΔcsgBA 突变株中，这种偏向低堆积区域的模式消失，噬菌体、溶原菌和整体宿主群体的空间分布变得很接近。作者由此认为，真正控制温和噬菌体空间传播的关键，不是单纯的生物膜厚度，而是细胞堆积密度和基质造成的扩散阻力。

时间尺度拉长以后，野生型和 ΔcsgBA 的差异更加明显。作者让生物膜先长 48 小时，再连续暴露于 λ 噬菌体 120 小时。野生型生物膜中的溶原菌比例逐渐增加，但到 96 小时 后稳定在大约 10% 左右，不再继续上升。相反，ΔcsgBA 生物膜中溶原菌比例持续快速上升，到 96 小时后可达到总群体的 80% 到 100%。这说明 curli 依赖的成熟生物膜结构不仅影响早期感染位置，也会长期限制温和噬菌体把更多宿主转化成溶原菌。作者还做了液体培养吸附实验，发现已有的 λ 溶原菌仍能吸附 λ 噬菌体，但因为具有超感染免疫，不会再支持同类噬菌体裂解增殖；这种吸附会降低游离噬菌体数量。因此，溶原菌本身也可能在外围形成一定的噬菌体缓冲层，不过作者判断，主导因素仍然是基质依赖的高密度细胞堆积对噬菌体扩散的阻挡。

文章非常关键的一部分，是作者发现溶原菌虽然在原始生物膜中比例不高，却特别容易进入流出的液体中。原因不是前噬菌体让细菌本身变得更容易脱落，而是溶原菌形成的位置本来就在生物膜外缘。外缘细胞堆积低，又暴露在流体剪切力下，同时周围还受到 λ 裂解感染造成的局部结构削弱，所以这些溶原菌比生物膜中心细胞更容易被带走。实验结果显示，流出液中的溶原菌比例显著高于原始生物膜中的总体溶原菌比例；作者还明确指出，溶原菌比系统中平均未溶原化细胞更容易分散，约高出 10 倍。当只看细胞堆积低于 0.2 的外围区域时，这个区域里的溶原菌比例与流出液中的比例相近，进一步说明流出液主要来自这些低密度外围层。

这种偏向性分散会影响生物膜之间的传播。作者把原始微流控腔室中的流出液收集起来，用来接种新的下游腔室。这个流出液里含有未感染细胞、溶原菌和游离 λ 噬菌体。新腔室经过 72 小时 生长后，作者发现下游生物膜中的溶原菌比例显著高于原始上游生物膜。换句话说，温和噬菌体在原始生物膜中只能把外围一部分细胞变成溶原菌，但这些溶原菌刚好更容易离开原地，并在新地点形成更高比例的溶原化群体。ΔcsgBA 突变株中没有出现这种上游和下游之间的差异，说明这一过程依赖野生型生物膜的空间结构。作者还做了 1:1 预先混合未感染细胞和溶原菌的实验，发现二者在生物膜中基本中性竞争，也没有出现溶原菌在流出液中富集的现象。这说明溶原菌偏向分散不是由溶原状态本身改变脱落生理造成的，而是因为它们在噬菌体入侵过程中被产生在了外缘。

作者还测试了一个很重要的问题：如果溶原菌已经混在生物膜里面，诱导它们进入裂解周期，释放出的噬菌体能不能从生物膜内部继续扩散并感染更多未感染细胞。实验设计是把 λ 溶原菌和未感染 E. coli 按 1:10 混合接种，让生物膜长 72 小时，然后用 42°C 热处理 40 分钟 诱导部分溶原菌进入裂解周期。结果在野生型生物膜中，新溶原菌产生非常少，与没有热诱导的对照相比几乎没有明显增加。这说明即便噬菌体是从生物膜内部释放出来的，成熟野生型生物膜的高密度结构仍然能限制它们传播。相反，在 ΔcsgBA 背景中，热诱导后新溶原菌迅速增加，最终溶原菌可达到群体的大多数；从 ΔcsgBA 生物膜流出液中回收到的噬菌体滴度也比野生型高约 10 倍。这个结果进一步证明，curli 相关的高密度细胞结构确实会阻止噬菌体在生物膜内连续扩散。

文章最后比较了温和噬菌体和纯裂解型噬菌体在生物膜中的传播策略。作者使用了三种噬菌体：能溶原化的 λ，纯裂解型 T7，以及去掉功能性 cI repressor、因此不能维持溶原化的 λΔcI。在原始上游生物膜中，T7 在早期表现最强，接种后大约 2 小时 就能达到最高感染细胞积累，随后由于大量细胞被裂解，感染细胞量迅速下降。λ 和 λΔcI 的局部感染增长更慢，不像 T7 那样快速爆发。可是到了下游新腔室，情况反过来了：T7 常常只能带来很少的感染细胞，有时甚至没有细胞成功定殖；而 λ 由于产生了能继续生长和分裂的溶原菌，在下游生物膜中感染细胞生物量持续增加。作者指出，在下游长期尺度上，λ 的感染细胞生物量比 T7 高出约 1000 倍，并且 λ 感染细胞能够在群体中占优势。由此可见，裂解型噬菌体更适合短时间、局部快速利用宿主；温和噬菌体则更适合靠溶原菌的分散和再定殖，在更长时间和更大空间尺度上传播。

结论

成熟 E. coli 生物膜的基质和细胞堆积结构会限制 λ 温和噬菌体扩散，使噬菌体、裂解感染和新形成的溶原菌主要集中在生物膜外缘。生物膜中心因此成为相对不容易被噬菌体接触的区域。溶原菌在原始生物膜中不会无限增加，而是在野生型结构中稳定到大约 10%；但由于它们产生在外缘低密度区域，它们更容易进入流出液，并在下游新生物膜中被放大。与纯裂解型噬菌体相比，温和噬菌体的优势不在于更能穿透成熟生物膜，而在于能把自己的基因组装进宿主细胞，让宿主作为可以生长、分裂、迁移的载体，把噬菌体基因带到新的生物膜中。

研究噬菌体和生物膜时不能只看液体培养里的平均感染率，也不能只看最终有多少细胞死亡，因为真实生物膜里的空间结构会直接决定噬菌体能到哪里、感染谁、哪些细胞能活下来并继续扩散。更进一步说，温和噬菌体的生态优势可能恰恰来自生物膜这种空间环境：在局部，它们受到扩散限制；在更大尺度上，它们通过溶原菌分散和再定殖实现传播。未来研究如果能把单细胞成像、空间建模、不同基质突变体、不同噬菌体生活史和多物种生物膜结合起来，就能更清楚地理解噬菌体如何塑造生物膜群落结构、水平基因转移和慢性感染中的微生物演化。