双重微滴式数字PCR实现乳制品两种高危致病菌同步精准检测

一、研究背景

乳制品富含蛋白质、乳糖等营养物质，同时也是食源性致病菌极易滋生的载体。其中阪崎克罗诺杆菌与单核细胞增生李斯特菌是乳制品安全重点防控的两类高危致病菌。阪崎克罗诺杆菌对婴幼儿具备极强致病性，被广泛关注于婴幼儿配方乳粉安全管控，感染后易引发脑膜炎、败血症等重症；单核细胞增生李斯特菌易感人群覆盖老人、孕妇及免疫功能低下人群，可通过乳制品途径造成食源性疾病暴发。

目前食品行业主流检测手段存在明显短板：传统微生物分离培养方法流程繁琐、检测周期长达数天，难以满足大批量样品快速筛查需求；常规荧光定量 PCR（qPCR）必须依靠标准曲线开展定量分析，容易受到乳制品内脂肪、蛋白等基质成分抑制，当样品内致病菌载量较低时，定量结果偏差较大，存在漏检风险。因此，建立能够同步检测两种致病菌、可实现核酸绝对定量的快速检测技术，对乳制品食品安全风险防控具备重要现实意义。

二、双重微滴式数字 PCR 检测体系构建

该研究选取特异性基因作为靶标开展体系开发：以ompA基因作为阪崎克罗诺杆菌特异性识别靶点，plcB基因作为单核细胞增生李斯特菌特异性识别靶点，依据基因保守序列设计对应的特异性引物与 TaqMan 探针，并构建阳性质粒作为标准模板。

研究系统开展反应条件梯度优化，调试引物、探针工作浓度与退火温度等关键参数，最终确定最优双重 ddPCR 反应体系与扩增程序，搭建起双通道同步检测平台，实现在单一反应体系内同时识别两种目标致病菌，摆脱单一检测方法只能逐一筛查致病菌的局限，显著提升样品检测通量。

三、完整方法学性能评价

科研团队从特异性、灵敏度、重复性多个维度对新建检测方法开展系统性验证。

在特异性试验中，选取肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、结核分枝杆菌等多种常见食源性微生物进行测试。结果显示，只有阪崎克罗诺杆菌与单核细胞增生李斯特菌产生特异性阳性信号，其余菌株均无扩增，不存在交叉反应，证明引物探针组合特异性可靠。

灵敏度试验结果表明，该双重 ddPCR 体系对阪崎克罗诺杆菌检出限为 7.51 拷贝 / 反应，单核细胞增生李斯特菌检出限可达 8.02 拷贝 / 反应，能够实现痕量致病菌核酸检出。

重复性测试结果显示，高低不同浓度质粒模板的批内、批间变异系数均低于 16%，定量结果波动小，方法稳定性满足定量检测标准。

四、实际乳制品样品比对验证

为检验方法在真实食品基质中的应用潜力，研究首先配制人工污染乳制品模拟样本，验证基质环境下的检测有效性；进一步收集 80 份市售乳制品样品，同步采用新建双重 ddPCR 方法与传统 qPCR 方法开展平行比对检测。

试验数据表明，双重微滴式数字 PCR 无需依赖标准曲线，直接完成核酸绝对定量，抗乳制品基质干扰能力更强。针对低污染水平的样品，双重 ddPCR 检出效果优于 qPCR，可以有效降低痕量致病菌带来的漏检风险，更契合市场乳制品样品常态化风险筛查场景。

五、技术价值与应用展望

本次建立的双重 ddPCR 检测体系最大优势是实现 “一管双检”，单次反应同步筛查两种重点致病菌，有效节约试剂成本、缩短检测时长。相较于传统检测手段，该方法兼具高灵敏度、良好重复性与绝对定量能力，可广泛应用于婴幼儿配方乳粉、液态奶、发酵乳等各类乳制品的风险监测。

从长远发展来看，本研究搭建的双通道检测框架具备拓展潜力，后续可增加更多致病菌靶标，开发多重微滴式数字 PCR 检测方案，实现多种食源性致病菌并行检测。该技术体系也为食品检测机构、乳制品生产企业开展致病菌快速精准检测提供新方案，助力食品安全风险早发现、早预警。

文献链接：DOI:10.7506/spkx1002-6630-202512-273