应用实时逆转录聚合酶链反应快速检测饮用水中的大肠杆菌

研究背景

大肠杆菌是饮用水微生物安全核心指示菌，传统国标平板分离培养法周期长达 24～48h，检测滞后性强，无法实现水质突发污染实时预警；欧盟各国饮用水管控标准严苛，亟需快速、精准、适配多地水源工况的活菌特异性分子检测手段。普通=DNA qPCR 无法区分活菌与死菌游离DNA，易出现假阳性，反转录RT-qPCR靶向活菌特异性mRNA，仅活性菌体可检出，具备特异性优势，但该方法在欧盟大范围饮用水体系的通用性、稳定性与现场适用性仍缺少规模化实测验证。

研究方法

选取欧盟不同气候、水源类型（地表水、地下水、管网末梢水）代表性区域饮用水样品；优化水样富集、RNA提取、反转录及qPCR整套反应体系；以大肠杆菌特异性功能基因mRNA为靶标；同步设置传统ISO标准培养法作为对照；评估方法检出限、特异性、精密度、抗水样基质干扰能力；开展大量实际水样平行比对检测，验证现场实用性与结果一致性。

主要结果

整套优化后的 RT-qPCR 特异性优异，仅目标大肠杆菌出现阳性扩增，沙门氏菌、克雷伯菌等近缘肠道菌、水中土著杂菌均无扩增信号；方法检出限可低至单拷贝级菌体，线性定量区间宽泛；相较DNA-qPCR，本体系可有效排除高温消毒、氯灭活后死菌残留DNA带来的假阳性；饮用水中天然腐殖酸、余氯等基质杂质对扩增抑制较弱，配套简单前处理即可消解基质干扰，批内、批间重复性良好。将检测全流程压缩至4 h以内，相较传统培养法耗时大幅缩减。

图1.RT-qPCR体系方法学性能验证

对欧盟多国水源水、出厂水、管网末梢水样同步采用 ISO 培养法与 RT-qPCR 检测：合格饮用水两类方法阴性结果吻合度极高；少量轻度污染水样中 RT-qPCR 检出阳性的时间显著早于培养法；部分低水平活菌污染样品，RT-qPCR 可精准定量活菌载量，传统培养法因菌体受损、低活性易出现漏检；整体两种检测结果相关性良好，RT-qPCR定量数值与培养计数具备显著线性相关关系；结合区域水质特征分析，地下水洁净水样检出稳定性最优，地表水高有机质水样仅需简易浓缩预处理即可保证检测准确度。

此外，广东环凯生物科技有限公司为食品和饮料中的大肠杆菌的快速检测提供了新的检测方案：HandyPlate®大肠杆菌/大肠菌群(ECC)测试片。

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图2.环凯产品示意图

研究结论

靶向大肠杆菌特异性mRNA的RT-qPCR 技术经过欧盟多区域饮用水大规模实测验证，特异性强、灵敏度高，能够特异性识别活菌、规避死菌 DNA 假阳性干扰，检测时长由传统培养1～2 d缩短至数小时；该方法在地表水、地下水、管网水等多种饮用水基质中稳定性佳，实验室间重现性好，定量结果与欧盟标准培养法高度吻合；可作为饮用水大肠杆菌常规筛查、突发水质污染应急快速预警的优选分子检测方案，为欧盟饮用水微生物在线快速监测标准化落地提供可靠技术支撑。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.envres.2025.121786.