噬菌体必要组成成分诱导细菌群落产生抗性

噬菌体本来是用来杀细菌的，但它杀死生物膜外层细菌后，会释放一种尾纤维蛋白 gp46。这个蛋白像一把会扩散的小剪刀，能剪掉肺炎克雷伯菌表面的荚膜。问题是，Kp11 噬菌体感染细菌时本来要先抓住荚膜，荚膜被提前剪掉后，后来的噬菌体就更难感染这些细菌。于是生物膜外层虽然一开始被打坏了，但内部和后续重新生长的细菌因为荚膜降低而暂时躲过感染，整个群落就表现出抗性。这个抗性不是细菌基因突变出来的，而是噬菌体感染过程自己制造出来的表型保护。

肺炎克雷伯菌生物膜为什么会很快对噬菌体产生群落水平抗性。过去关于噬菌体抗性的研究，主要关注单个细菌细胞，比如细菌突变噬菌体受体、使用限制修饰系统、CRISPR-Cas 系统，或者启动其他抗噬菌体防御系统。可是细菌在真实环境和感染过程中通常不是单个生活，而是形成生物膜或密集群落。群落里的抗性不一定来自基因突变，也可能来自空间结构、胞外基质、代谢休眠区域、庇护位点，或者噬菌体裂解细胞后释放出来的物质。作者关注的核心问题是，噬菌体感染肺炎克雷伯菌生物膜后，为什么生物膜一开始被裂解，后来却能重新长起来，并且对高滴度噬菌体也不再敏感。

这项研究发现了一种很反直觉的群落抗性机制。噬菌体杀死细菌后，会释放新的完整噬菌体颗粒，也会释放一些没有装配进完整噬菌体的结构蛋白。对有尾噬菌体来说，头部、尾部和尾纤维常常先分别装配，再组合成完整颗粒；有些噬菌体会产生相对过量的尾纤维，所以裂解液中可能存在游离尾纤维。本文发现，肺炎克雷伯菌噬菌体 Kp11 的尾纤维蛋白 gp46 进入生物膜后，会降解细菌表面的荚膜。由于 Kp11 感染肺炎克雷伯菌需要先识别荚膜，荚膜提前被游离 gp46 降解后，后续完整噬菌体反而找不到进入细胞的第一步入口，导致整个生物膜出现表型抗性。也就是说，噬菌体感染产生的副产物，反而帮细菌群落建立了保护状态。

作者使用的是 Klebsiella pneumoniae 生物膜和裂解性噬菌体 Kp11。Kp11 属于 Podoviridae，靶向带 K2 荚膜 的肺炎克雷伯菌。实验在微流控系统中进行，生长室长 10 mm、宽 2.4 mm、厚 6 μm。这种结构可以让大量细菌形成紧密、稳定、近似二维的生物膜，同时保持培养基持续流动。因为厚度很薄、细胞又非常密集，只有生物膜外缘直接接触流动培养基，营养和外源分子要进入内部主要靠扩散。这种设计既能模拟自然生物膜的空间异质性，又方便对整个群落进行定量成像。

实验开始时，作者让生物膜长到约 500 μm，再用低滴度 10⁴ PFU/ml Kp11 处理 1 小时，随后撤掉外源噬菌体。处理结束时，只有生物膜外缘少数局部区域出现感染和细胞死亡，作者用 PI 荧光标记死亡细胞。约 2 小时 后，感染扩展到整个生物膜外缘，出现明显裂解，生物膜停止生长。由于外源噬菌体已经撤掉，后续感染扩展主要来自生物膜内噬菌体复制产生的新噬菌体。让人意外的是，大约 10 小时 后，生物膜重新开始生长，虽然重新生长速度比感染前慢得多，约为 10 μm/h，而感染前约为 70 μm/h。随后作者再用高滴度 10⁸ PFU/ml Kp11 处理，生物膜生长没有受到明显影响，说明它已经获得了对 Kp11 的抗性。

这种抗性不是普通意义上的突变抗性。生物膜恢复生长时，整个外缘几乎是均匀重新生长，而不是只有少数抗性突变细胞形成局部克隆扩张。如果抗性主要来自随机突变，理论上应该看到零散位置先长出抗性菌斑。作者把重新生长后的生物膜细菌收集出来，放到含高滴度 Kp11 的平板上检测真正遗传抗性细胞比例，结果发现抗性细胞比例低于 3%。这个比例远低于生物膜均匀重新生长所产生的新细胞比例，后者可达 16.61% 到 58.49%。因此，作者判断生物膜的重新生长主要来自 表型抗性，而不是大量细胞发生了遗传突变。

作者原本也考虑过细菌自身的抗噬菌体防御系统是否造成了这种抗性。肺炎克雷伯菌菌株中预测存在多个噬菌体防御系统，但敲除这些系统后，生物膜对 Kp11 的抗性并没有消失，说明原因不在这些经典细胞内防御系统。随后作者注意到，噬菌体感染后，生物膜相差显微图像中出现了一条明亮条带，并且这条条带随着感染推进向生物膜内部移动。作者判断这可能代表某种分子在生物膜中向内扩散。用 FITC 标记完整 Kp11 噬菌体后发现，完整噬菌体只能进入生物膜外缘约 60 μm，不能深入内部。因此，那条向内移动的条带不是完整噬菌体本身，而更可能是噬菌体裂解细菌后释放出来的较小分子。

真正的关键分子是 Kp11 的尾纤维蛋白 gp46。作者纯化 gp46 后单独处理生物膜，发现它能诱导出与噬菌体感染时相似的相差条带。更重要的是，用 gp46 预处理生物膜 3 小时 后，再用高滴度 10⁷ PFU/ml 噬菌体攻击，生物膜变得不再容易被感染。这说明完整噬菌体不是唯一决定因素，游离尾纤维 gp46 本身就足以让生物膜进入抗噬菌体状态。作者据此提出，噬菌体裂解外层细菌时释放出的未装配 gp46，可能向生物膜内部扩散，并在完整噬菌体到达之前改变细菌表面。

接下来，作者证明 gp46 的作用对象是 细菌荚膜。许多病原菌表面有厚厚的多糖荚膜，它会遮挡细胞膜上的潜在噬菌体受体，因此很多噬菌体先用尾纤维结合荚膜，再依靠尾纤维的去聚合酶活性降解荚膜，最后才能接触细胞膜上的次级受体并注入遗传物质。作者把 mCherry 融合到 gp46 的 N 端，发现 mCherry-gp46 能积累在野生型肺炎克雷伯菌表面，但不能积累在荚膜缺陷株 ΔwcaJ 表面。wcaJ 编码荚膜合成起始糖基转移酶，所以 ΔwcaJ 缺少正常荚膜。这个结果说明 gp46 是特异性结合荚膜的。

gp46 不只是结合荚膜，还会降解荚膜。作者观察到 mCherry-gp46 在细菌表面的荧光会随时间下降，并在 25 分钟 内消失，提示 gp46 结合后把荚膜降解，随后从细胞表面释放。用 Alcian blue 染色的 SDS-PAGE 分析进一步确认 gp46 具有荚膜去聚合酶活性。作者还构建了没有去聚合酶活性的突变蛋白 gp46mut，发现 gp46mut 可以稳定积累在有荚膜细菌表面，而不是像野生型 gp46 那样很快消失。这说明 gp46 的完整过程是先结合荚膜，再降解荚膜，降解后从细胞表面脱离，然后可以继续作用于其他带荚膜细胞。

在生物膜中，gp46 的去聚合酶活性决定了它能不能向内部推进。没有去聚合酶活性的 mCherry-gp46mut 主要停留在生物膜边缘，不能有效进入内部；有活性的 mCherry-gp46 则形成一条向内移动的荧光带，这条带与感染时看到的相差条带位置一致。因为外部培养基持续供应 mCherry-gp46，如果某一区域没有荧光，说明该区域荚膜已经被降解，gp46 已经不再稳定停留。作者进一步先用 gp46mut 标记生物膜中的荚膜，再加入噬菌体，发现噬菌体感染也会推动 gp46mut 标记向内部逐渐进入，说明感染过程中释放的游离 gp46 确实在生物膜中向内传播并降解荚膜。

作者还用转录反应进一步验证细菌确实感受到了 gp46 造成的表面变化。RNA-seq 显示，浮游细菌受到 gp46 处理后，编码外膜孔蛋白的 ompK26 明显上调。随后作者构建了 ompK26 启动子荧光报告菌株。gp46mut 处理生物膜时，ompK26 没有明显变化；野生型 gp46 处理时，穿透前沿后方区域出现明显 ompK26 上调；噬菌体处理也诱导了类似的 ompK26 上调。作者还用另外三个代表性基因确认了这一现象。这个结果说明，噬菌体感染导致游离 gp46 进入生物膜、降解荚膜，并引起细菌表面相关的转录响应。

整套机制可以这样理解。由于生物膜细胞非常密集，完整噬菌体扩散受限，感染从生物膜外缘开始，并逐渐向内部推进。外缘细菌被噬菌体裂解后，会释放更多完整噬菌体，也会释放未装配的尾纤维 gp46。gp46 比完整噬菌体小，扩散更容易，且能通过反复结合和降解荚膜向内部推进。它会跑在完整噬菌体前面，提前清除细菌表面荚膜。可是 Kp11 感染又需要先结合荚膜才能启动，因此当完整噬菌体随后到达时，很多细菌因为已经失去荚膜而不再适合被 Kp11 感染。这样，生物膜就形成了低荚膜区域，并出现均匀重新生长。

作者通过调节 gp46 水平证明了这个机制。如果外源加入更多 gp46，荚膜降解会更快，生物膜恢复生长所需时间更短。实验中在加入噬菌体 3 小时 后补加不同浓度 gp46，结果显示 gp46 浓度越高，生物膜越快恢复生长。相反，作者用 dCas9 抑制噬菌体中 gp46 基因转录，让感染过程中产生的游离 gp46 变少，生物膜重新生长的时间显著延长。这个结果说明，游离 gp46 不是旁观者，而是决定群落抗性形成速度的关键因子。

生物膜恢复生长后仍然长得很慢，是因为感染并没有完全停止。作者工程化 Kp11，在噬菌体基因组中插入 sfgfp，使噬菌体复制时表达绿色荧光，从而观察哪些细菌仍在被感染。结果显示，即使生物膜已经重新生长，外缘仍有一部分细菌持续发生噬菌体感染。原因是外缘细菌在增殖过程中会不断合成新的荚膜，而游离 gp46 又会不断降解荚膜。某个外缘细菌最终是否被感染，取决于它在遇到完整噬菌体之前，荚膜是否已经被游离 gp46 降解。于是恢复后的生物膜增长，是细菌增殖和噬菌体裂解之间的净结果，只是增殖速度超过了裂解速度。

作者也通过调节细菌荚膜水平证明了这一点。他们把原生 wcaJ 替换成 IPTG 诱导型 wcaJ，用 IPTG 控制荚膜合成水平，并用经典尿酸法确认 IPTG 浓度越高，荚膜水平越高。按照模型预测，如果荚膜越多，gp46 要花更长时间才能形成低荚膜区域，生物膜恢复生长就会更慢。实验结果符合预测，IPTG 浓度升高后，生物膜恢复生长时间延长，恢复后的生长速率也降低。更进一步，如果从培养生物膜一开始就用 100 μM IPTG 强诱导荚膜，整个生物膜可以被噬菌体裂解。这个结果很有意思，因为通常荚膜被认为保护细菌，但在这种特定噬菌体系统里，过多荚膜反而让 Kp11 有足够受体持续感染，使抗性难以建立。

文章还讨论了这个发现对噬菌体治疗的影响。噬菌体治疗常常与抗生素联用，但不同组合可能产生协同，也可能相互抵消。因为荚膜会影响抗生素进入细菌，作者比较了野生型和 ΔwcaJ 荚膜缺陷株对多种抗生素的 MIC。缺失 wcaJ 会降低卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素的 MIC，说明去掉荚膜会让细菌更容易被这些氨基糖苷类抗生素抑制；但会升高多黏菌素 B 和 E 的 MIC，说明去掉荚膜反而让多黏菌素效果变差；对环丙沙星和新霉素没有明显影响。对应地，Kp11 与卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素联用时，可以在较低抗生素浓度下快速抑制生物膜，且没有观察到恢复生长；但与其他抗生素联用效果并不明显。

多黏菌素的结果尤其提醒人们，噬菌体和抗生素联用并不一定总是更好。多黏菌素 B 单独高剂量处理可以明显破坏生物膜，但如果先用 Kp11 处理，再加入多黏菌素 B，这种破坏作用反而被消除。作者进一步证明，单独用 gp46 就足以消除多黏菌素 B 对生物膜的破坏作用，说明拮抗效应来自 gp46 降解荚膜后改变了细菌对多黏菌素的敏感性。这个结果很重要，因为它说明设计噬菌体—抗生素组合时，不能只看噬菌体能不能杀菌，还要看噬菌体裂解液中的结构蛋白会怎样改变细菌表面和药物反应。

作者还发现，荚膜限制大分子进入生物膜，而 gp46 降解荚膜后可以打开大分子进入通道。mCherry 蛋白本身不能有效进入生物膜，但 gp46 处理后，mCherry 可以明显扩散进入生物膜。这提示噬菌体感染后释放的 gp46 不只是诱导抗噬菌体抗性，也暴露出生物膜的新弱点。作者用纤维素酶做了验证。单独用纤维素酶分散生物膜需要很高浓度，达到 160 U/ml；但如果与噬菌体联合，只需要 8 U/ml 纤维素酶就能使整个生物膜分散。这个结果说明，gp46 降解荚膜后增强大分子渗透，可以被用来设计新的抗生物膜策略。

这篇文章的结论是，肺炎克雷伯菌生物膜对噬菌体 Kp11 的抗性，主要不是由少数突变体扩张造成，而是由噬菌体裂解后释放的未装配尾纤维 gp46 造成的群落水平表型抗性。gp46 能结合并降解细菌荚膜，而且由于它比完整噬菌体更容易进入生物膜，会在完整噬菌体到达前提前清除荚膜。Kp11 需要荚膜作为初级受体来启动感染，所以荚膜被提前降解后，细菌反而变得对 Kp11 不敏感。这个机制让裂解性噬菌体和细菌可以在生物膜中长期共存，因为外缘细菌一边合成新荚膜并增殖，一边有一部分继续被噬菌体感染裂解。

这项研究还说明，噬菌体诱导的抗性同时会暴露治疗弱点。降解荚膜可能让某些抗生素更有效，比如卡那霉素、庆大霉素和妥布霉素；也可能削弱某些药物，比如多黏菌素 B 和 E。它还可以促进蛋白等大分子进入生物膜，使噬菌体与纤维素酶这类大分子联用成为可能。作者还提出一个更反直觉的鸡尾酒设计思路：荚膜被尾纤维降解后，原本被荚膜遮住的潜在受体可能暴露出来，因此可以把靶向有荚膜菌的噬菌体，与只能感染无荚膜菌的噬菌体组合起来，可能更有利于清除生物膜。

未来微生物研究噬菌体和细菌互作时，不能只看完整噬菌体颗粒和单个细菌细胞，也要看噬菌体裂解后释放出的各种蛋白、酶和细胞内容物如何在群落空间中扩散。生物膜不是均一体系，较小的分子可能比完整噬菌体跑得更快，从而提前改变细菌表面、药物敏感性和后续感染结果。对噬菌体治疗来说，未来不能简单认为噬菌体加抗生素一定更强，而要根据荚膜、尾纤维、受体暴露、药物进入方式和处理顺序来设计组合。对基础微生物生态来说，这篇文章也说明，裂解产物本身可以成为塑造噬菌体—细菌共存的关键因素，未来如果结合微流控生物膜、单细胞成像、噬菌体工程、荚膜定量、空间组学和不同噬菌体鸡尾酒实验，就能更准确地利用噬菌体裂解带来的弱点，而不是让它意外诱导群落抗性。