2.6 CFU/mL！上海团队开发金黄色葡萄球菌“显色快检”新方法，食品安全检测有望更灵敏

金黄色葡萄球菌是食品微生物检测中经常关注的一类致病菌。它可以存在于人体皮肤、鼻腔等部位，也可能在食品加工、储存过程中进入食品。部分金黄色葡萄球菌能够产生肠毒素，因此，一旦食品受到污染并在适宜条件下发生繁殖，就可能带来食源性疾病风险。目前，用于金黄色葡萄球菌检测的方法已经比较成熟，包括传统培养、免疫学检测以及PCR、qPCR等核酸检测技术。培养法的应用时间较长，但检测周期相对较长；PCR等方法速度更快，不过通常需要专门仪器和实验条件。对于食品生产现场或者需要快速筛查的场景来说，检测方法是否能够在保证准确性的同时减少时间和设备依赖，仍然是研究者不断尝试解决的问题。

近日，来自上海交通大学医学院、上海健康医学院、上海理工大学、复旦大学附属浦东医院等单位的研究团队，在国际期刊Talanta发表了一项研究，报道了一种基于RPA、CRISPR/Cas12a和纳米酶的金黄色葡萄球菌比色检测方法。这套方法前端采用RPA进行核酸扩增，随后利用CRISPR/Cas12a识别目标序列，最后通过Meso-UiO-66(Zr)@PtPdNPs纳米酶催化反应产生颜色信号。

根据论文结果，该方法的线性检测范围为1.5×10¹—1.5×10⁸ CFU/mL，检测限达到2.6 CFU/mL。在牛奶、果汁和自来水等加标样品中，平均回收率为99.0%—103.9%，相对标准偏差低于5.9%。

从目标DNA开始：RPA负责扩增，Cas12a负责识别

整个检测过程首先从目标DNA的扩增开始。研究人员采用RPA作为前端扩增方法。RPA属于等温核酸扩增技术，不需要像PCR一样经历反复的升温和降温，因此在快速检测研究中应用较多。完成扩增后，产物进入CRISPR/Cas12a反应体系。在crRNA的引导下，Cas12a能够识别特定的DNA序列。当目标序列存在时，Cas12a被激活，并表现出旁切活性，对体系中设计好的DNA探针进行切割。这里的探针并不直接负责产生颜色，而是连接Cas12a识别过程和后续的显色反应。随着目标DNA数量增加，Cas12a被激活的程度提高，DNA探针被切割得更加充分。后面的显色信号也因此发生变化。所以，从技术逻辑上看，RPA主要解决的是目标核酸量不足的问题，而Cas12a负责进一步确认扩增产物是否属于预设靶标。

从DNA切割到颜色变化

完成核酸识别后，信号需要被转换成一个更容易读取的结果。研究团队使用的是一种名为Meso-UiO-66(Zr)@PtPdNPs的纳米复合材料。它以介孔金属有机框架Meso-UiO-66(Zr)为载体，并负载PtPd双金属纳米颗粒。论文结果显示，这种材料同时具有氧化酶样、过氧化物酶样和过氧化氢酶样活性。其中，氧化酶样和过氧化物酶样活性参与了TMB显色反应。与部分传统显色体系不同，这套系统不需要额外加入外源性H₂O₂。纳米酶能够通过自身的氧化酶样和过氧化物酶样活性形成连续反应，使无色TMB最终转化为蓝色产物。研究人员通过检测652 nm处的吸光度变化，对最终信号进行定量分析。不过，这里的信号关系并不是“细菌越多，颜色越深”。恰恰相反，随着金黄色葡萄球菌浓度升高，RPA扩增产生更多目标DNA，Cas12a被更充分地激活，DNA探针也被切割得更多。最终能够参与后续反应的纳米酶减少，因此蓝色信号会逐渐减弱。也就是说，在这套体系中，目标菌浓度升高，对应的是652 nm处吸光度下降。

图1 Meso-UiO-66(Zr)@PtPdNPs纳米酶与CRISPR/Cas12a-RPA系统集成的高灵敏度金黄色葡萄球菌比色生物传感器示意图^[1]

为什么要使用PtPd双金属纳米酶？

材料部分是这项研究的另一个重点。研究人员没有直接使用单一金属纳米颗粒，而是选择将Pt和Pd共同负载在介孔MOF材料上。Meso-UiO-66(Zr)提供了相对开放的孔道结构，而PtPd双金属纳米颗粒则提供催化活性。论文表征结果显示，Meso-UiO-66(Zr)本身的比表面积为953 m²/g。在负载PtPd纳米颗粒后，比表面积下降至308 m²/g，与金属颗粒进入或覆盖部分孔道结构的结果相符。研究团队还比较了不同材料的催化性能。结果显示，PtPd双金属体系的氧化酶样和过氧化物酶样活性优于单独负载Pt或Pd的材料，也优于微孔结构载体上的类似材料。因此，这里的材料设计并不是简单地增加一种“催化剂”。介孔结构影响底物的传递，PtPd双金属则进一步提高催化反应效率，两者共同决定最终的显色表现。

检测限达到2.6 CFU/mL

在完成各项反应条件优化后，研究人员对这套传感体系进行了性能测试。随着金黄色葡萄球菌浓度升高，体系在652 nm处的吸光度逐渐下降。按照论文给出的结果，吸光度变化与细菌浓度的对数之间具有较好的线性关系，线性范围覆盖1.5×10¹—1.5×10⁸ CFU/mL，相关系数为R² = 0.998，计算得到的检测限为2.6 CFU/mL。研究人员随后又测试了体系的选择性。实验中加入了志贺氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌等菌种作为对照，这些非目标菌没有产生与金黄色葡萄球菌相同的检测响应。五次平行实验的相对标准偏差为1.3%。

稳定性实验则考察了探针的短期保存情况。在4℃条件下放置7天后，检测信号仍能保持初始值的86.9%。这些实验基本覆盖了一个传感方法常见的几个评价指标。不过需要注意的是，论文中的稳定性测试时间只有7天，长期储存性能以及不同批次材料之间是否存在差异，还需要更多数据来判断。

放到真实样品里试一试

纯培养体系中的检测结果通常比较理想，但食品样品就没有这么“干净”了。以牛奶为例，其中含有大量蛋白质和脂肪；果汁中则有糖、有机酸以及天然色素。这些成分都有可能影响前面的核酸提取，也可能干扰后面的扩增和显色反应。因此，研究团队选择了牛奶、果汁和自来水进行加标实验。样品经过10倍稀释后，加入不同浓度的金黄色葡萄球菌，再按照建立好的方法进行检测。最终得到的平均回收率99.0%—103.9%，相对标准偏差低于 5.9%。另外，研究人员还选取牛奶样品，与商业荧光qPCR试剂盒进行了对比。两种方法对于阳性和阴性样品的判断结果一致。从这部分结果来看，至少在论文测试的几种基质中，这套方法能够正常工作。不过，加标实验和真正的自然污染样品还是两回事。实验室中人为加入的菌液浓度和状态相对明确，而实际食品中的细菌可能经历过冷藏、加工或其他环境变化，同时还可能伴随着复杂的背景微生物。因此，如果后续要进一步评价方法的实用性，自然污染样品的数据会更有参考价值。

最终读数很简单，但前面的流程并不算少

虽然最后呈现出来的是颜色变化，但整套检测过程并不是简单地把样品加入试剂后等待结果。按照论文目前的实验流程，前面仍然需要进行DNA提取，随后是RPA扩增、Cas12a反应以及显色检测。单独看，每一步都不算特别复杂，但把它们连在一起后，对现场操作还是有一定要求。论文作者也提到，后续可以考虑将不同反应进一步整合，例如尝试构建一管式检测体系，并结合便携设备完成结果读取。这可能也是这类方法后续最需要解决的问题之一。

实验室里，多几个移液步骤通常不是什么大问题；但如果检测场景换成食品生产现场、市场抽检或者基层检测机构，操作步骤一多，结果的稳定性就更容易受到人为因素影响。另外，比色检测确实比较直观，但“看颜色”本身也有局限。颜色差异很明显时比较容易判断，但当不同样品之间的变化不够大时，光线、背景以及操作者的判断都可能带来影响。如果后续能够用简单的读数装置，或者通过手机对颜色进行数字化分析，结果可能会更加统一。样品适配性也是后续绕不开的问题。论文目前测试了牛奶、果汁和自来水，但食品种类远不止这些。高脂肪肉制品、高盐食品、调味品以及成分复杂的即食食品，都可能需要重新调整前处理和检测条件。

这套方法的思路，其实就是把几个环节接起来

如果从整个技术设计来看，这项研究并不是单纯做了一种“颜色检测”。RPA、CRISPR/Cas12a和纳米酶在这里分别承担不同任务。RPA先把目标核酸扩增出来；Cas12a负责确认这个目标是不是研究人员想找的序列；最后，纳米酶把前面的分子识别过程转换成颜色信号。这样一来，原本发生在分子水平上的DNA识别过程，最终可以通过颜色变化读出来。当然，现在这套方法仍然是一种实验室检测方案。要真正进入常规食品检测，还需要继续解决样品处理、反应整合、试剂保存以及成本等问题。不过，这项研究至少提供了一条比较明确的技术组合路线：RPA负责扩增，Cas12a负责识别，纳米酶负责把识别结果转换成可读取的信号。后续能不能把这些步骤进一步压缩，做成更方便使用的检测产品，可能才是这类技术真正值得继续研究的地方。

参考文献：[1] Yang Zhou, Hehua Zhang, Hongmin Gao, Huan Zhu, Ying Liu, Hongkun Ma, Hongzhi Pan, Shengzhong Rong, Dong Chang. A cascade colorimetric sensor based on Meso-UiO-66(Zr)@PtPdNPs nanozyme with triple enzyme activities and RPA-CRISPR/Cas12a for Staphylococcus aureus detection. Talanta, 312 (2027) 130451.