发夹构象介导SRH级联等温扩增电化学生物传感器，实现单增李斯特菌灵敏检测

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）不是食品检测里最常见的病原菌，却是最不能掉以轻心的一类。它耐受性强，低温下也能存活，甚至继续繁殖。对乳制品、肉制品、即食食品和冷藏食品来说，这一点很麻烦。冷藏本来是控制微生物风险的重要手段，但对单增李斯特菌并不总是足够。

它的另一个问题是后果重。李斯特菌病发病率相对不高，但在孕妇、新生儿、老年人和免疫功能低下人群中，病情可能进展很快。文献中常提到的病死率为20%–30%。因此，单增李斯特菌检测一直强调两个词：早发现，低丰度。

常规方法各有用处。培养法仍是重要基础，但耗时；PCR灵敏度高，却需要仪器和较规范的实验条件；免疫分析做起来方便一些，但交叉反应和假阳性不能忽略。华东师范大学团队近期在《Talanta》发表的一项研究，尝试走另一条路：把适配体识别、磁分离、三级等温扩增和电化学读出接在一起，用于单增李斯特菌检测。

论文题目是“A hairpin conformational change-mediated SRH cascade isothermal amplification assisted electrochemical biosensor for Listeria monocytogenes detection”。名字很长，拆开看其实就是三件事：先识别目标菌，再通过SDA-RCA-HCR级联放大信号，最后用电极读出来。

图1 等温扩增电化学生物传感器示意图[1]

这套方法的起点不是直接扩增细菌DNA，而是先把细菌识别事件转化为一条核酸触发链T。研究人员将单增李斯特菌适配体和T链组装成Apt/T双链，再固定到链霉亲和素修饰磁珠上。样品中有目标菌时，适配体优先结合细菌，T链被释放出来。随后用磁分离去掉磁珠和细菌，上清液中的T链进入后续反应。

这个设计的好处是比较直观的。细菌本身不容易直接进入多级核酸放大体系，而T链可以。目标菌越多，释放出的T链越多，后面产生的电化学信号也就越强。

接下来，T链打开发夹探针HP。没有T链时，HP保持闭合构象，Nt.BbvCI识别位点不完整，体系不容易自行启动；T链加入后，HP构象改变，在Klenow Fragment（3′-5′ exo-）作用下被延伸，形成完整的Nt.BbvCI识别位点。Nt.BbvCI切割后生成F产物，而T链还能继续参与下一轮反应。这一步相当于第一轮放大。

F产物随后与Padlock探针结合，并在T4 DNA连接酶作用下形成环状Padlock。这个环状模板会被固定到金电极表面，为后面的滚环扩增做准备。

三级信号放大

环状Padlock被电极上的Cap探针捕获后，phi29 DNA聚合酶启动RCA，生成一条带有大量重复序列的长单链DNA。它不是终点，而是继续作为支架，结合多个引发链I。随后，带生物素标记的H1和H2发夹探针发生HCR，在电极表面形成较长的双链DNA结构。

这些生物素位点会进一步结合链霉亲和素-HRP。HRP催化H₂O₂和OPD反应，产生差分脉冲伏安法（DPV）可以检测的还原电流。这样，最初的细菌识别事件经过T链、SDA、RCA和HCR几轮转换，最终变成电极上的电流变化。

研究团队用CV和EIS跟踪了电极修饰过程。Cap固定、MCH封闭、RCA延伸、HCR形成之后，电子传递阻力逐步上升，说明电极表面的结构确实在一层层增加。凝胶电泳也验证了Apt/T形成、T释放、SDA、Padlock环化、RCA和HCR等步骤。

检测限达到5 CFU/mL

级联反应对条件很敏感。研究团队优化了HP浓度、Klenow Fragment用量、Nt.BbvCI用量、Cap浓度、phi29 DNA聚合酶用量、RCA时间、H1/H2浓度、引发链I浓度、HCR时间和SA-HRP用量。最终条件为：HP 0.4 μM，Klenow Fragment 3.0 U，Nt.BbvCI 8.0 U，SDA时间60 min；Cap 0.2 μM，phi29 DNA聚合酶5.0 U，RCA时间40 min；I 1.0 μM，H1/H2 0.4 μM，HCR时间30 min，SA-HRP 2.0 U。

信号放大的效果很明显。单独RCA时，电流变化为-13.87 μA；加入SDA后变为-21.13 μA；完整SDA-RCA-HCR体系达到-32.89 μA。HCR这一级没有白加，它确实把电极表面的信号分子数量继续堆高了。

最终检测性能也比较亮眼。该方法在15至1.5 × 10⁸ CFU/mL范围内与单增李斯特菌浓度对数呈线性关系，回归方程为ΔI = -2.826 lg C - 7.075，R² = 0.9966，检测限为5 CFU/mL（S/N = 3）。

但也要看到另一面。SDA、Padlock环化、RCA、HCR、HRP结合和DPV检测，每一步都需要条件控制。对实验室研究来说，这不是问题；对现场快速检测来说，步骤多就意味着操作门槛和出错点都在增加。

食品样品应用效果良好

实际样品验证中，研究团队选择了脱脂奶粉溶液、莴苣、奶酪和鸡肉。脱脂奶粉溶液加标浓度为10²至10⁴ CFU/mL时，回收率为97.0%–106%。在莴苣、奶酪和鸡肉中，该方法与平板计数法结果接近，相对误差均低于9%。其中莴苣为7.03%，奶酪为8.73%，鸡肉为8.82%。

这组数据说明，体系在几类常见食品基质中能工作。莴苣、奶酪、鸡肉的组成差异比较大，蛋白质、脂肪、颗粒物和其他干扰成分也不同。结果能够与平板计数法保持接近，至少说明适配体捕获、磁分离和电极读出没有被这些基质完全破坏。

不过，加标样品和真实自然污染样品之间还有距离。自然污染样品中的细菌可能受损、分布不均，甚至处于低活性状态；样品前处理、洗涤效率和基质残留都会影响最终结果。所以，这项方法已经显示出潜力，但仍需要更多真实样品和批间稳定性数据。

它的优势很清楚：检测限低，信号放大链条完整，读出设备有小型化空间。尤其是电化学读出，相比荧光显微镜或实时PCR平台，更容易和便携式设备、一次性电极结合。

短板也同样清楚。流程复杂，酶体系多，电极修饰和多步孵育都需要控制。若面向企业自检、基层监管或现场抽检，后续必须把试剂预装、反应盒集成和读数设备小型化做好。否则，实验室里的高灵敏度很难直接转化成现场可用的效率。

平台化扩展是值得继续看的方向。作者提到，只要调整HP和T等序列，理论上可以适配其他病原菌。若后续能扩展到沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等目标，同时保持低背景和稳定读数，这套SRH级联策略的价值会更高。

目前，环凯等企业已经围绕单增李斯特菌建立了培养基、显色培养基、核酸快检试剂和标准方法配套产品，可用于食品企业自检、第三方检测和监管抽检。这类电化学传感器如果完成工程化，更适合做补充工具：用于低丰度样品筛查、快速确认，或者一些需要便携读数的场景。

归根结底，这项研究的看点不只是“检测限做到5 CFU/mL”，而是它展示了一种把适配体识别和多级等温扩增接到电化学读出上的办法。它有明确的工程化难点，也有继续往产品形态靠近的空间。现在说替代谁还早，但作为单增李斯特菌高灵敏检测的技术储备，值得关注。

参考文献

[1] Lv J, Geng X, Tang S, Li S, Han M, Tu F, Zhang F, Wang Q. A hairpin conformational change-mediated SRH cascade isothermal amplification assisted electrochemical biosensor for Listeria monocytogenes detection. Talanta. 2027;312:130397. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2026.130397.

企业服务参考：广东环凯微生物科技有限公司（环凯生物），单核细胞增生李斯特菌检测整体解决方案，覆盖选择性培养基、显色培养基、核酸快检试剂盒及相关标准方法配套产品，可服务于食品生产企业自检、第三方检测机构筛查和监管部门日常抽检。官网 https://www.huankai.com，热线400-001-8883。